特定行业污水中四环素类抗生素的调查分析

刘熙熙+沈晓东++汪卉

【摘要】：建立了测定水样中四环素类抗生素的高效液相色谱分析方法，采取多种前处理方法进行优化与对比，以苏州市阳澄湖周围水体作为研究对象，调查总结其中三类四环素类抗生素的含量。在色谱条件中采用乙腈、草酸水溶液作为流动相进行梯度洗脱，流速为1mL/min，波长为300nm，分析时间10分钟，线性关系良好。

【关键词】：四环素类抗生素；高效液相色谱；萃取

【引言】：抗生素（antibiotics）是一种天然或者半人工合成的，能在低微浓度下有选择性地抑制或影响生物。自从1928年发现青霉素以来，人类开始广泛使用抗生素，并且在家禽饲养、水产养殖和食品加工等方面广泛运用。随之而来的是在环境中残留的抗生素污染越来越严重。

抗生素污染已成为目前国际研究热点之一。水环境下抗生素的研究集中在北美等发达国家，国内也已陆续展开了相关工作。已有的研究很少涉及能够真正反映养殖场药物使用情况的排水口水体和下游水体中抗生素的变化。通过深入关注和了解有关抗生素方面的一些新闻报道和研究文献，发现养殖场附近的水体中残留抗生素较多，其中含量最多，最普遍的便是四环素类抗生素。 为了促进动物生长和预防疾病爆发，普遍都在家畜、家禽和水产养殖饲料中添加抗生素，一部分将在生物体内吸收或轉化，并以代谢物的形式排出体外。

为了研究四环素类抗生素对养殖水体的污染情况，将以过去的研究数据为基础，通过高效液相色谱检测方法，多种前处理方式，对苏州鱼塘周围水体进行采样分析，调查总结苏州特定水环境中四环素类抗生素的来源及含量，以期为达到控制和去除四环素类抗生素提供方向和依据。

1、材料与方法

1.1 仪器

Agilent1100分析型高效液相色谱仪（美国安捷伦公司）；Eclipse Plus C18（150*2.1mm，3.5μm）；氮吹仪TTL-DCI；快速混匀器SK-1；离心机TGL-16G；恒温水浴锅；超声波清洗器KQ-100E；C18 6mL（500mg）小柱。

1.2 试剂

甲醇、乙腈、丙酮（色谱纯）；超纯水；四环素、土霉素、金霉素固体标准物质；草酸（分析纯）。

1.3 高效液相色谱分析条件

选用色谱柱（Eclipse Plus C18（150*2.1mm，3.5μm）），柱温：30℃，波长：300nm，流速：1mL/min，流动相：乙腈/0.01mol/L草酸，进样量：20μL，流动相中草酸PH：2.4，采用梯度洗脱程序（表1），其中A相为乙腈，B相为0.01mol/L草酸。

1.4实验方法

1.4.1标准溶液配置

称取三种四环素类抗生素标准物质，用甲醇配制单标储备液及混标储备液，置于棕色瓶内放冰箱避光保存。

1.4.2标准曲线制备

将混标储备液与超纯水混合，形成浓度为1.00、2.00、4.00、6.00、8.00ppm的标准系列溶液，按色谱条件进样，以浓度（ppm）为横坐标，峰面积为纵坐标绘制标准曲线。

1.4.3水样前处理

水样在前处理之前均采用0.22μm尼龙滤膜进行过滤。

1） 离子液体辅助分散液液微萃取

保持混合有机物：40μL（乙腈：1-己基-3甲基咪唑六氟磷酸盐 = 1：1）和水样体积不变，同时改变酸化的溶液（乙酸和草酸）时，观察离子液体（1-己基-3甲基咪唑六氟磷酸盐）的萃取效率。最后用离子液体用无菌注射器抽出，200μL的流动相复溶。

2） 丙酮-无水硫酸铵双水相萃取

配制一定量的水样和硫酸铵盐溶液，置于一定温度水浴中使盐溶解；移取6 mL储备液至10 mL 离心管中，加入0.8mL丙酮；涡旋3min后离心5min至分相；用1 mL注射器从上相取样。

3） 无水乙醇+ 丙酮-硫酸铵体系萃取

同丙酮-无水硫酸铵体系实验方案类似，关键在于丙酮与乙醇的比例关系。确定无水乙醇和丙酮以1∶2 组合溶于水相中效果最佳。

4） 固相萃取

样品净化： C18柱在使用前先用甲醇水溶液（2：1）进行活化后加入水样，适当控制流速，待样品液全部流出后用95%甲醇水溶液洗涤柱子，弃去流出液，再加入5mL甲醇洗脱，收集洗脱液。

样品浓缩： 将洗脱液于氮吹仪吹干后，加入1mL流动相定容。

1.4.4样品测定

定容后经0.22μm的尼龙滤头过滤，吸取20μL进样，进行HPLC分析，记录三种抗生素保留时间及峰面积。

2 、结果与讨论

2.1色谱条件优化

选取乙腈、甲醇和0.01mol/l草酸溶液作为流动相，流速：0.8ml/min，波长：267nm，对三种物质分离，结果显示OTC和TC没有完全分离，且峰

值有拖尾现象；随后，改用乙腈和0.01mol/l草酸溶液作为流动相，进行梯度洗脱，流速：1mL/min，波长：300nm三者分离度都有所提高，OTC和TC相比OTC出峰效果明显，两者出峰时间较接近，通过优化梯度洗脱中流动相比例以及比例变换时间，将检测时间缩短到10分钟之内，使分析时间大大缩短。

1.土霉素；2.四环素；3.金霉素

图1.混合标准溶液分离色谱图

2.2萃取方法选择

双水相萃取和分散液液微萃取技术相比固相萃取成本低，操作简单，变通性强，为提高萃取效果，对萃取剂进行多次筛选，最终确定以无水乙醇+ 丙酮-硫酸铵体系萃取，按适当比例进行萃取进样，结果表明无水乙醇和丙酮以1∶2 组合溶于水相中效果最佳。

固相萃取不用大量互不相溶的溶剂，富集倍数、回收率高，选取萃取柱C18，甲醇为洗脱溶剂萃取，控制适当流速，效果显著。

两种萃取技术最终结果显示固相萃取技术萃取效率较高。

2.3工作曲线与检出限

抗生素 回归方程 相关系数 标准偏差 方法检出限

OTC y = 18.49x - 0.357 0.997 2.08% 0.15

TC y = 17.20x - 0.737 0.999 1.40% 0.14

CTC y = 9.794x - 2.488 0.997 1.88% 0.08

表2.三种抗生素的线性关系分析和方法检出限

按照不同浓度制定标准曲线，由表2可以看出三种四环素类抗生素的工作曲线线性关系良好，并计算得出方法检出限MDL。

结 论

本研究采用固相萃取和双水相萃取多种前处理方法对水样进行富集，结果表明固相萃取效果较好，但并不表示双水相萃取技术不可行，该技术成本低，耗时也比固相萃取少，是一个有研究价值的技术，还需从各个条件下进行优化，固相萃取技术已成熟，经C18柱富集后，以乙腈-草酸溶液为流动相进行梯度洗脱，流速为1mL/min，波长为300nm，结果表明线性关系良好。

【参考文献】：

[1]周启星， 罗义， 王美娥. 抗生素的环境残留、生态毒性及抗性基因污染[J]. 生态毒理学报， 2007， 2（3）：243-251.

[2]魏瑞成，葛峰，陈明等.江苏省畜禽养殖场水环境中四环类抗生素污染研究[J].农业环境科学学报，2010，29（6）：1205-1210.endprint