不同提取方法对哈蟆油中雌二醇含量的影响

李兴月，张 楠，翁丽丽，邱智东，张 强

(长春中医药大学，长春 130117)

不同提取方法对哈蟆油中雌二醇含量的影响

李兴月，张 楠，翁丽丽，邱智东，张 强*

(长春中医药大学，长春 130117)

目的 利用3种不同方法提取哈蟆油中雌二醇并测定其相应雌二醇含量，优选出提取哈蟆油中雌二醇最佳方法。方法 采用ODS-C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流动相为磷酸水-乙腈-甲醇（63:32:5）；检测波长：280 nm；柱温：30 ℃；流速：1.0 mL/min。结果 90%乙醇提取法中雌二醇含量为7.5 μg/g，超临界提取法中（无夹带剂）雌二醇含量为1.25 μg/g，超临界提取法中（有夹带剂）雌二醇为0.83 μg/g。结论 利用90%乙醇提取哈蟆油中雌二醇方法最佳。

哈蟆油；雌二醇；超临界二氧化碳流体萃取

哈蟆油(ovlductus ranae)系蛙科动物中国林蛙（rana temporaria chensitumsis darid.)雌蛙的干燥输卵管。哈蟆油味甘、咸，性平，归肺、肾经，具补肾益精、养阴润肺生津的功效[1-6]。哈蟆油中含有雌二醇，雌二醇除了可以缓解由于年龄增加，身体机能下降而引起的雌激素分泌不足之外，对肌体的生长、代谢、发育、繁殖还起到重要的调节作用[7]。哈蟆油在作为治疗心脑血管疾病、肝病、贫血、癌症等疾病的辅助用药方面，可以增强人体免疫力，提供高蛋白营养物质，对减肥节食者大有好处，是临床常用营养保健品[8]。本研究采用不同提取方法，测定相应提取方法中雌二醇含量，筛选出最佳提取方法，为哈蟆油的进一步研究与开发提供理论依据。

1 仪器与材料

1.1 仪器 岛津高效液相色谱仪Prominence-ILC-2030（岛津企业管理中国有限公司）；JA2603B万分之一天平（上海天美天平仪器有限公司）；FA1004B十万分之一天平（上海佑科仪器仪表有限公司）；水浴锅HH-S2（上海越众仪器设备有限公司）；旋转薄膜蒸发仪（上海申顺生物科技有限公司）；全自动超纯水机（上海富诗特仪器设备有限公司）；超临界二氧化碳流体萃取仪（杭州明凯科技有限公司）。

1.2 试药 雌二醇（规格：100 mg，购于中国食品药品鉴定所）；95%乙醇（500 mL，分析纯，北京化工厂）；丙酮（500 mL，分析纯，北京化工厂）；甲醇（500 mL，分析纯，北京化工厂）；磷酸（500 mL，分析纯，北京化工厂）；甲醇（4 L，色谱纯，Fisher公司）；乙腈（4 L，色谱纯，Fisher公司）；哈蟆油经长春中医药大学药学院翁丽丽教授鉴定为正品。

2 方法及结果

2.1 哈蟆油中雌二醇的提取 1）取哈蟆油约20 g，粉碎，过5号筛，精密称定，置圆底烧瓶中，加20倍90%乙醇加热回流提取2次，2 h/次，过滤，合并滤液，回收乙醇，蒸干，备用[9-11]。2）取哈蟆油约20 g，粉碎，过2号筛，精密称定，放入萃取釜中，压力为300 mPa，温度为40 ℃，以无水乙醇作为夹带剂，流速为0.15 mL/min，提取时间1 h。提取完毕，回收乙醇，蒸干，备用。3）取哈蟆油约20 g，粉碎，过2号筛，精密称定，放入萃取釜中，压力为300 mPa，温度为40 ℃，提取时间1 h。提取完毕，回收乙醇，蒸干，备用。

2.2 雌二醇的含量测定

2.2.1 色谱条件 ODS-C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）； 流动相：磷酸水-乙腈-甲醇（63:32:5）；检测波长：280 nm； 柱温：30 ℃； 流速：1.0 mL/min；进样量20 μL； 理论塔板数按雌二醇不低于3 000计算[12]。

2.2.2 标准品溶液的制备 取雌二醇对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1mL含0.003 mg的溶液。

2.2.3 供试品溶液的制备 1）取2.1.1项下哈蟆油提取物约0.5 g，精密称定，加50 mL丙酮溶解，过滤，蒸干，残渣加甲醇定容至25 mL容量瓶[13-15]。2）取2.1.2项下哈蟆油提取物约0.5 g，精密称定，加50 mL丙酮溶解，过滤，蒸干，残渣加甲醇定容至25 mL容量瓶。3）取2.1.3项下哈蟆油提取物约0.5 g，精密称定，加50 mL丙酮溶解，过滤，蒸干，残渣加甲醇定容至25 mL容量瓶。

2.2.4 方法学考察

2.2.4.1 线性范围的考察 精密称取雌二醇标准品适量，定容至10 mL容量瓶，吸取一定量标准品溶液制成0.000 375 、0.000 75 、0.001 5、0.003、0.004 5、0.006 mg/mL溶液，分别吸取20 μL注入高效液相色谱仪，测峰面积，分别是2 788、5 925、12 508、25 620、39 614、51 393。以浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标，制作标准曲线。得回归方程为Y=8 737 045.554 5X-506.143 3，相关系数r=0.999 7，结果表明：雌二醇进样量在0.007 5～0.12 μg范围内，呈现良好的线性关系。

2.2.4.2 精密度考察 精密吸取“2.2.3”项下供试品溶液20 μL，按上述色谱条件连续进样6次，测定雌二醇峰面积，分别是26 398、26 251、27 077、26 189、25 490、26 830，RSD=2.1%，表明仪器精密度较好。

2.2.4.3 重现性试验 取同一批哈蟆油样品按“2.2.3”项下方法制备供试品溶液6份，进样20 μL，测定雌二醇的峰面积，分别是25 748、26 478、26 194、26 946、26 253、26 293，RSD=1.5%，表明该方法具有较好的重现性。

2.2.4.4 稳定性试验 取同一批次供试品溶液，室温下放置0、4、8、12、24、36 h，进样20 μL，测定雌二醇峰面积，分别是26 575、26 547、26 145、26 316、26 119、27 089，RSD=1.4%，表明雌二醇在36 h内稳定。

2.2.4.5 加样回收率试验 取样品6份，精密称定，加入雌二醇对照品一定量，按“2.2.3”项下方法制备，测定含量，计算回收率，平均回收率为97.13%，RSD=1.58%。结果见表1。

表1 雌二醇回收率试验结果

2.2.5 样品测定 吸取标准品溶液、不同提取方法的供试品溶液20 μL，注入高效液相色谱仪，按照上述色谱条件进行测定，按照外标一点法计算哈蟆油中雌二醇的含量，结果见表2，图1、图2。

表2 哈蟆油中雌二醇含量测定结果

图1 雌二醇对照品高效液相色谱图

3 讨论

90%乙醇提取法中雌二醇含量为7.5 μg/g，超临界提取法中（无夹带剂）雌二醇含量为1.25 μg/g，超临界提取法中（有夹带剂）雌二醇为0.83 μg/g，因此利用90%乙醇提取哈蟆油中雌二醇方法最佳。

哈蟆油中含有雌二醇，雌二醇是动物体内重要的雌激素，对机体的代谢有着重要的影响，如雌二醇可以使胰岛素水平增加，从而维持血糖浓度相对稳定；雌二醇可以使血管壁的通透性和脆性降低，因此当雌二醇减少时，常出现血管脆性增加和出血倾向；雌二醇可以升高血浆生长素，促进DNA和RNA的合成，又可以加速氨基酸进入细胞，因此能促进蛋白质的合成；雌二醇可以促进胆固醇的降解和排泄，同时又能改变胆固醇在体内分布，使血浆和大动脉壁中的胆固醇转移至肝脏，从而降低血浆胆固醇水平；雌二醇可以抗凝血，防止血栓形成而延缓动脉粥样硬化[16]。哈蟆油是我省的道地药材，又是滋补身体的佳品，近年来也引来了越来越多的学者关注，研究[17-20]表明，哈蟆油可以抗氧化、抗衰老、抗疲劳。但是哈蟆油抗氧化、抗衰老的作用机制以及哈蟆油中哪一种成分可以评价哈蟆油的真伪还有待于进一步研究。

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图2 哈蟆油药材样品高效液相色谱图

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Effects of different extraction methods on estradiol content

LI Xingyue, ZHANG Nan, WENG Lili, QIU Zhidong, ZHANG Qiang*
(Changchun University of Chinese Medicine, Changchun 130117 China)

Objective The estradiol in Oviductus Ranae was extracted by three different methods and the corresponding estradiol content was determined to optimize the best method for extracting estradiol from Oviductus Ranae. Methods ODS-C18 chromatographic column (250 mm×4.6 mm, 5µm) was used, the mobile phase consisted of water-acetonitrile-methanol (63: 32: 5); the detection wavelength was 280 nm; the column temperature was 30 ℃; the fow rate was 1.0 mL/min. Results Estradiol content was 7.5μg / g in 90% ethanol extraction method, 1.25μg /g in supercritical fuid extraction method (without entrainer), estradiol in supercritical fuid extraction Was 0.83μg /g. Conclusion The method of extracting estradiol from Oviductus Ranae by 90% ethanol is the best.

Oviductus Ranae; estradiol; supercritical carbon dioxide fuid extraction

R284.2

A

2095-6258(2017)04-0541-03

2017-01-05）

10.13463/j.cnki.cczyy.2017.04.009

吉林省中医药科技项目（20150309009YY）。

李兴月（1993-），女，硕士研究生，主要从事中药学研究。

*通信作者：张 强，男，电话-13039218920， 电子信箱-735110462@qq.com