两种检测方法评价厚朴对白念珠菌黏附的影响

周艳萌 向晓波 冯琳颖 董华

(1.遵义医学院微生物与免疫学实验室；2.遵义医学院附属口腔医院口腔外科；3.遵义医学院医学与科技学院2011级；4.遵义医学院医学与科技学院2012级，遵义 563003)

·技术与方法·

两种检测方法评价厚朴对白念珠菌黏附的影响

周艳萌1向晓波2冯琳颖3董华4

(1.遵义医学院微生物与免疫学实验室；2.遵义医学院附属口腔医院口腔外科；3.遵义医学院医学与科技学院2011级；4.遵义医学院医学与科技学院2012级，遵义 563003)

XTT法；结晶紫法；白念珠菌；黏附

白念珠菌是人体常见的机会致病性真菌，可存在于正常人口腔、上呼吸道、肠道及阴道，易在义齿、人工插管如尿道插管、气管插管等植入性设备表面定植并进一步形成生物膜。生物膜的形成可保护菌体免受药物的杀伤和免疫系统的攻击。黏附是生物膜成膜的关键，也是白念珠菌致病的关键步骤[1]。本实验拟通过结晶紫法与XTT法观察中药厚朴对白念珠菌黏附的影响，并对两种检测方法进行评价。

1 材料与方法

1.1 材料

白念珠菌 (ATCC 10231)由遵义医学院微生物与免疫学实验室提供。厚朴购于遵义市芝林大药房。RPMI1640培养基 (GIBCO公司),YPD液体培养基依据文献配制[2]，1%结晶紫染液 (结晶紫粉末2 g,溶于20 mL无水乙醇。草酸铵0.8 g，溶于80 mL蒸馏水。将两者充分混匀过滤备用)[3]，XTT/PMS应用液按照试剂盒说明书配置。二甲基亚砜 (DMSO)(天津市光复精细化工研究所，分析纯)。

1.2 方法

白念珠菌先在沙氏琼脂培养基上传代培养，然后接种于YPD液体培养基。

厚朴煎煮液的制备 厚朴为烤干的生药，按戴自英[4]提供的方法制备生药浓度为1 g/mL的水煎液,滤器过滤除菌后，用RPMI1640培养液按二倍稀释法将厚朴煎煮液稀释成以下浓度:125、62.5、31.3、15.6和7.8 μg/mL。

结晶紫法检测厚朴煎煮液对白念珠菌黏附作用的影响 浓度为1×106cells/mL的菌液接种于96孔板中，每孔100 μL菌液，37℃分别培养1 h、2 h和3 h后，吸弃培养基，PBS洗去未黏附菌[5]，每孔加入上述各浓度药液100 μL，每组8个复孔，同时设阴性对照孔 (含菌液培养基)及空白对照孔，37℃培养24 h，每孔加入1%的结晶紫染液150 μL染20 min后，PBS洗3次，每孔加入150 μL 95%乙醇脱色10 min，检测脱色液在570 nm的吸光度 (A值)。计算抑菌率。每组实验重复3次。

XTT法检测厚朴煎煮液对白念珠菌黏附作用的影响 分组处理同上，37℃培养24 h后，XTT法检测450 nm的吸光度 (A值)。计算抑菌率。每组实验重复3次。按以下公式计算抑菌率：抑菌率=(阴性对照孔A值-实验组A值)/(阴性对照孔A值-空白对照孔A值)×100%[6]。

1.3 统计学处理

2 结 果

2.1 结晶紫法观察不同浓度厚朴煎煮液抗白念珠菌黏附作用

结果显示厚朴煎煮液对白念珠菌的黏附具有抑制作用，同一黏附时间内其抑制作用随药物浓度的升高而增强，抑制作用具有浓度依赖性。随着菌黏附时间的延长，抑制率也有相应升高。同一黏附时间内，除菌液处理1 h组15.63 mg/L和7.81 mg/L两个浓度组外，其余各实验组与阴性对照组相比，差异均有统计学意义 (P<0.05)。见表1。

2.2 XTT法观察不同浓度厚朴煎煮液抗白念珠菌黏附作用

结果显示：厚朴煎煮液对白念珠菌的黏附具有抑制作用，同一黏附时间内其作用具有一定的浓度依赖性，菌液处理1 h各实验组与阴性对照组相比，差异均有统计学意义 (P<0.05)。随着黏附时间的延长，抑制率有减弱趋势，见表2。

组别浓度(mg/L)1h2h3hA值抑制率(%)A值抑制率(%)A值抑制率(%)阴性对照组01.46±0.04-1.49±0.03-1.72±0.04-厚朴煎煮液组125.001.38±0.04*5.721.36±0.05*8.431.48±0.04*14.0162.501.40±0.03*4.021.37±0.05*7.851.48±0.05*13.8831.251.41±0.03*3.421.38±0.05*7.421.49±0.06*13.4815.631.41±0.053.711.38±0.04*7.291.50±0.05*12.677.811.46±0.020.191.44±0.05*3.411.55±0.03*9.88

注：*.与阴性对照组比较，P<0.05

组别浓度(mg/L)1h2h3hA值抑制率(%)A值抑制率(%)A值抑制率(%)阴性对照组00.38±0.04-0.35±0.06-0.45±0.05-厚朴煎煮液组125.000.23±0.03*39.920.31±0.0511.510.35±0.06*21.8462.500.23±0.04*38.800.31±0.0512.610.4±0.0610.0631.250.25±0.05*34.620.31±0.0711.340.4±0.0611.6815.630.28±0.04*27.370.32±0.078.450.42±0.056.637.810.29±0.04*24.470.33±0.046.040.44±0.032.73

注：*.与阴性对照组比较，P<0.05

3 讨 论

中药厚朴为木兰科木兰属植物厚朴或凹叶厚朴的干燥干皮、根皮及枝皮。现代药理试验证明厚朴具有广谱抗菌、抗肿瘤、抗炎、保护心脑血管、抗溃疡以及抗凝血等作用[7]。田玉珠等[8]研究发现厚朴活性成分和厚朴酚对体外白念珠菌黏附及其生物膜的形成及厚度均有抑制作用。中药煎剂是我国应用最早最广泛的中药剂型[9]，厚朴煎煮液采用煎煮法获得，其中含有厚朴酚及和厚朴酚等活性成分，具有抗白念珠菌的作用。本文旨在采用结晶紫和XTT两种方法比较厚朴煎煮液对白念珠菌的黏附有无抑制作用及两种方法检测有无差别。结晶紫是一种碱性染料，能与带负电荷的细胞表面分子和胞外基质中多聚糖结合，活菌、死菌和基质均可被染色[10]。XTT即甲基四氮盐，是一种黄色水溶性物质，它可在线粒体脱氢酶的作用下降解为棕色的四氮盐-甲臜，反应过程中颜色变化能反映出存活细胞数量，并可通过分光光度计定量测定，以光密度值反映白念珠菌生物膜细胞生长活力[11]。本研究发现两种方法均测出厚朴煎煮液对白念珠菌黏附具有抑制作用。结晶紫法中随着菌液黏附时间的延长，厚朴煎煮液对白念珠菌抑制率升高。分析其原因可能是由于结晶紫染色法的实验结果受到很多因素的影响，如结晶紫浓度、染色时间、洗涤时间等，同时结晶紫染色法不能区分活菌、死菌，基质也能被染色[12]。而XTT法中产生的四氮盐-甲臜可溶于水，颜色变化反映的是活菌的数量。XTT法检测发现厚朴煎煮液对白念珠菌黏附1 h的抑制率最高，随着菌液黏附时间的延长，抑制作用减弱，其原因可能是由于黏附时间延长有利于白念珠菌生物膜的形成，进而对药物的抗性也增强了。而在125 mg/mL浓度3 h组的抑制率高于2 h组，可能是由于人为操作的误差，具体原因有待进一步验证。就本实验的目的而言，XTT法能更确切地检测厚朴煎煮液对白念珠菌的黏附抑制作用。

[1] 汪天明，严园园，施高翔，等.黄连解毒汤乙酸乙酯提取物对白假丝酵母菌黏附作用的影响[J].中国微生态杂志，2014,26(4)：391-396.

[2] 倪玲，肖 蕾，陈 刚，等.中草药抗白色念珠菌活性成分研究进展[J].中国消毒学杂志，2014,31(5)：503-505.

[3] 周艳萌，江吉富，金明哲.医学微生物学实验教程[M].第1版.西安：第四军医大学出版社，2014:63.

[4] 戴自英.临床抗菌药物学[M].第1版.北京:人民卫生出版社,1985:377-378.

[5] 向晓波，周艳萌，冯琳颖，等.基于厚朴酚对白色念珠菌黏附性及其生物膜形成的影响探讨其抗龋作用[J].首都医科大学学报，2015,36(6)：942-945.

[6] 许颖，莫文静，付爽，等.鱼腥草素钠对白色念珠菌磷脂酶体外作用的研究[J].口腔医学研究，2014,30(5):396-399.

[7] 殷帅文，何旭梅，郎锋祥，等.厚朴化学成分和药理作用研究概况[J].贵州农业科学，2007，35(6):133-135.

[8] 田玉珠，王健平，杨景云，等.和厚朴酚对根管内白色念珠菌生物膜作用的体外研究[J].中国微生态学杂志，2013，25(2):154-156.

[9] 孟喜成，袁文广，李杰.中药煎剂的科学制备[J].中国药物与临床,2011,11(11):1310-1312.

[10] 李福明，汪洋，汪少华,等.黄芩苷对白色念珠菌生物膜形成的体外抑制作用[J].海峡药学,2016,28 (3):224-226.

[11] Ramage G，Walle K，Wickes B，et al.Standardized method forinvitroantifungal susceptibility testing ofCandidaalbicansbiofilms[J].Antimicro Agents Chemother，2001，45(9):2475-2479.

[12] 蓝英，郭卓然，付娇娇，等.应用三种方法观察副溶血性弧菌生物被膜[J].生物工程，2015,36(8)：183-186.

[本文编辑] 王 飞

贵州省大学生创新创业计划 (201413653016)

周艳萌，女 (汉族)，硕士，副教授.E-mail:307879470@qq.com

R 379.4

B

1673-3827(2017)12-0159-03

2016-12-06