TNF-α多肽抑制剂的合成及初步活性筛选

曹颖男

广州市中山大学新华学院，广东广州 510520

TNF-α多肽抑制剂的合成及初步活性筛选

曹颖男

广州市中山大学新华学院，广东广州 510520

目的 初步探究TNF-R1的胞外区第四功能域CRD4衍生多肽对TNF-α与受体TNF-R1结合过程的影响。方法 以CRD4的部分序列为模板设计衍生小肽片段，采用生物活性酶联免疫吸附测定法 (BioLISA)观察所合成的小肽对于TNF-α与其受体TNF-R1结合情况的影响。结果 小肽Pep 3在浓度分别为20，40，60，80，100，120 μM可剂量依赖性抑制TNF-α与其受体TNF-R1的结合；然而肽段Pep 1和Pep 2均未表现明显的抑制效果。结论 TNF-R1的CRD4的A1模块衍生小肽Pep 3能够有效抑制TNF-α与其受体TNF-R1结合，提示该序列所在区域是影响TNF-α与其受体TNF-R1结合的关键部位。

TNF-α；TNF-R1；CRD4；短肽；BioLISA

肿瘤坏死因子(Tumor necrosis factor-α，TNF-α)是一种主要由单核细胞/巨噬细胞产生的、具有广泛生物学活性的细胞因子。在类风湿关节炎，肠炎和感染性休克等疾病的发生、发展中占有很重要的地位[1-2]。TNF-α主要通过与其位于细胞膜上的I型受体(TNF-R1)的细胞外区域结合之后，来启动其信号通路。TNF-R1的细胞外区域包含四个亚功能域，分别是CRD1(residues15-53)，CRD2(residues 54-97)，CRD3(residues 98-138)和 CRD4(residues 139-166)。其中CRD1，CRD2和CRD3分别由一个A型模块和一个B型模块构成，CRD4不同于其他3个亚功能域，它是由一个A模块(residues 139-150)和一个结构不规则的C模块(residues 153-172)构成[3-4]。显然对于各个亚功能域来说，A模块是相对保守的结构，极有可能在TNF-α和TNF-R1的结合过程中发挥重要作用，但目前国内外对于CRD4的A模块在TNF-R1与TNF-α相互识别的过程中所起到的作用鲜有报道。本研究针对于TNF-R1的CRD4区域A模块设计衍生小肽，检测其对于TNF-α和TNF-R1的结合的影响。

1 实验材料

1.1 主要试剂

2-Chlorotrityl chloride树脂和Fmoc保护氨基酸等购自吉尔生化（上海）公司。人TNF-α和人TNF-α BioLISAkit试剂盒购自奥地利Bender Medsystems公司。短肽S11K和WP9QY由中山大学药学院卜宪章教授友情馈赠。

1.2 实验仪器

固相多肽合成反应器，电子分析天平，酶标仪。

2 实验方法

2.1 多肽的合成及质谱表征

采用Fmoc/tBu法[5]逐步合成小肽。所得肽分子量经ESI-MS质谱分析。

2.2 TNF-αbinding测试

TNF-α以PBS缓冲液稀释至浓度为20 ng/mL，与等体积的肽溶液混合，配成200 μL反应体系，25℃孵育1 h。以等量的PBS缓冲液及DMSO与TNF-α孵育，分别作为空白对照和溶剂对照。S11K肽和WP9QY肽分别为阴性对照和阳性对照。洗板2次。加100 μL/孔样品稀释液至所有的标准品孔内，将孵育后的反应体系50 μL/孔转移至ELISA板。向各孔内加50μL样本稀释液，50 μL Biotin-Conjugate(1:100稀释)，4℃过夜。次日洗板5次。加Strepavidin-HRP(1:100稀释)，25℃孵育1 h。 洗板5次。加入 TMB 底物 100 μL/孔，25℃避光反应 15～20 min。450 nm测吸光度。

3 实验结果

3.1 衍生小肽的氨基酸序列信息和ESI-MS质谱表征

成功合成3条衍生小肽，样品的测量值与计算值相符合，表征正确。见表1。

表1 TNF-R1第四区衍生小肽的ESI-MS质谱分析

3.2 衍生小肽的活性筛选

小肽Pep 3显著抑制TNF-α与TNF-R1的结合，且呈剂量依赖性关系；而Pep 1和Pep 2均未表现出抑制作用。见图1。

图1 衍生小肽对TNF-α与TNF-R1结合过程的影响

4 讨论

该研究发现TNF-R1的CRD4区域衍生小肽Pep 3(residues145-152)能够显著抑制TNF-α和TNF-R1的结合。提示TNF-R1的CRD4的A1模块区域内能够影响TNF-α与其受体TNF-R1结合的关键作用区域位于Leu145至Ser152之间。有学者发现在TNF-R1上连接CRD3和CRD4的一段区域(residues 130-149)以及CRD4上的一段区域(residues 146-165)都参与了TNF-α和 TNF-R1的结合[6]。这一点与目前的研究结果在部分程度上是一致的。虽然目前尚缺乏关于Pep 3与TNF-α或TNF-R1的作用模式方面的数据，但这并不影响所推测出的结论，那就是：TNF-R1的CRD4区能够直接参与TNF-α与TNF-R1的结合，从而影响了二者的相互作用。

[1]Kim EY,Moudgil KD.Immunomodulation of autoimmune arthritisbypro-inflammatorycytokines[J].Cytokine，2017（4）：12.

[2]Hirano T,Mori Y.Anti-atherogenic and anti-inflammatory properties of glucagon-like peptide-1,glucose-dependent insulinotropic polypepide,and dipeptidyl peptidase-4 inhibitors in experimental animals[J].J Diabetes Investig，2016，Suppl 1:80-86.

[3]Naismith JH,Devine TQ,Kohno T,et al.Structures of theextracellular domain of the type I tumor necrosis factor receptor[J].Structure，1996（4）:1251-1262.

[4]Takasaki W,Kajino Y,Kajino K,et al.Structure-based design and characterization of exocyclic peptidomimetics that inhibit TNF alpha binding to its receptor[J].Nat Biotechnol，1997（15）:1266-1270.

[5]Merrifield B.Solid phase synthesis[J].Science，1986（232）:341-347.

[6]Naismith JH,Devine TQ,Brandhuber BJ,et al.Crystallographic evidence for dimerization of unliganded tumor necrosis factor receptor[J].J Biol Chem，1995（270）:13303-13307.

Synthesis and Preliminary Activity Screening of TNF-α Polypeptide Inhibitors

CAO Ying-nan
Xinhua College of Zhongshan University,Guangzhou,Guangdong Province,510520 China

Objective To preliminarily study the effect of fourth functional domain CRD4-derived tripetides in extracellular region of TNF-R1 on the combination course of TNF-α and receptor TNF-R1.Methods The derived tripetide segments were designed by taking some sequences of CRD4 as models and the effect of small peptides on the combination course of TNF-α and receptor TNF-R1 was observed by the BioLISA.Results The concentrations of small peptide Pep 3 were respectively 20,40,60,80,100,and 120 μM,which could inhibit the combination of TNF-α and receptor TNF-R1,but the Pep 1 and Pep 2 had no obvious inhabitation effect.Conclusion The A1 module-derived-small peptide Pep 3 of CRD4 of TNF-R1 can effectively inhabit the combination of TNF-α and receptor TNF-R1,which reminds that the region in which the sequence is located is the key site that can influence the combination of TNF-α and receptor TNF-R1.

TNF-α;TNF-R1;CRD4;Small peptide;BioLISA

R96

A

1672-5654（2017）07（a）-0097-03

2017-04-06）

10.16659/j.cnki.1672-5654.2017.19.097

曹颖男（1983-），女，山东烟台人，博士，讲师，研究方向:药理学。