罗丹明6G恒波长同步荧光猝灭法测定痕量亚硝酸根

李岚，郝洪庆，林嘉森

(嘉应学院 化学与环境学院，广东 梅州 514015)

罗丹明6G恒波长同步荧光猝灭法测定痕量亚硝酸根

李岚，郝洪庆，林嘉森

(嘉应学院 化学与环境学院，广东 梅州 514015)

建立了恒波长同步荧光猝灭测定微量亚硝酸根的新方法。研究表明：在HCl介质中，Δλ=25 nm，亚硝酸根对溴酸根氧化罗丹明6G具有催化作用，使罗丹明6G的同步荧光发生猝灭，且猝灭程度与亚硝酸根量形成线性关系。方法的检出限为0.68 μg/L，线性范围为2～36 μg/L。该方法可用于火腿肠中亚硝酸根含量的测定，能得到满意结果。

恒波长同步荧光猝灭法；罗丹明6G；亚硝酸根；溴酸根

亚硝酸盐是一种允许使用的食品添加剂，在食品生产中用作护色剂，有发色和抑菌作用，能增强肉质风味，所以被广泛使用于食品中，但同时亚硝酸盐毒性较强，摄入量大可以使血红蛋白变成高铁血红蛋白，使其失去输氧能力，另外，亚硝酸盐还可以与胺类物质生成强致癌物质亚硝胺[1]。因此，我国严格控制亚硝酸盐的使用量，腌腊肉制品类如中式火腿、酱卤肉制品亚硝酸盐的残留量(以亚硝酸钠计)≤30 mg/kg[2]。因此，建立研究测定食品中痕量亚硝酸盐的灵敏分析方法对于食品安全和人体健康具有十分重要的意义。

亚硝酸根的分析方法有很多，但各有利弊。分光光度法[3]所用的偶联试剂毒性较大，可造成二次污染。

化学发光分析法[4,5]具有灵敏度高、操作简单、选择性好、仪器简单，但发光体系单一，同时要求操作人员技术水平要高。荧光法[6,7]快速、灵敏、操作简单、干扰少、试剂易得，但其条件不易准确控制。同步荧光法[8]测定亚硝酸根的报道较少，恒波长同步荧光法具有选择性好、灵敏度高、干扰少等特点。本文基于在酸性介质中，亚硝酸根对溴酸钾氧化罗丹明6G 具有催化作用[9-11]，且亚硝酸根的浓度与体系同步荧光强度猝灭程度有关，研究了测定痕量亚硝酸根的最佳实验条件，提出了恒波长同步荧光猝灭法测定微量亚硝酸根的新方法。

1 实验部分

1.1 实验仪器与试剂

LS-55荧光分光光度计 美国PE公司；AL-400电子分析天平 梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司；888搅拌机 樱达生活电器公司；Z2水浴锅 巩义市英峪予华仪器厂。

KBrO3、氯化钾、七水硫酸镁、氯化钙(无水) 广州化学试剂厂；罗丹明6G Aladdin Industrial Corporation；尿素、硼砂、硫酸锌、亚硝酸钠、氯化钠 广东光华化学厂有限公司；盐酸 西陇化工股份有限公司。实验所用试剂均为分析纯，水为超纯水。

亚硝酸根标准溶液：用亚硝酸钠配成亚硝酸根浓度为1 μg/mL的贮备液，用时稀释至0.1 μg/mL；0.02 mol/L溴酸钾溶液；1×10-4mol/L罗丹明B溶液。双汇火腿肠、双汇鸡肉火腿肠：福建省力诚食品有限公司。

1.2 实验方法

在25 mL比色管中加入盐酸，摇匀，加入溴酸钾溶液、罗丹明6G溶液、亚硝酸根标准溶液，加去离子水定容至刻度，摇匀，置于恒温水浴锅中9 min，再取出，迅速加入尿素溶液，摇匀。将溶液移入石英比色皿中，在荧光分光光度计上以波长差Δλ=25 nm测定荧光强度F。在相同条件下测定空白试剂F0(即不加0.1 μg/mL亚硝酸根标准溶液)，计算ΔF=F0-F。

2 结果与讨论

2.1 同步荧光光谱

罗丹明6G属三苯甲烷碱性染料，能发出很强荧光。

图1 罗丹明6G的光谱图Fig.1 Spectrogram of rodamin 6G

注：1为激发光谱；2为发射光谱；3为同步荧光光谱(Δλ=25 nm)。

由图1可知，罗丹明6G的激发波长为524 nm，发射波长为552 nm，Stokes位移(Δλ=λem-λex)较小，为28 nm，因此杂散光会对谱图产生影响。而采用固定波长同步扫描，得到的同步荧光谱图中半宽峰窄，强度比较大，这样可减小杂散光带来的误差。

在盐酸介质中，溴酸钾氧化罗丹明6G 得到的产物为无色、无荧光的物质，而加入亚硝酸盐对反应起加速反应的作用，但对体系的最佳同步波长不产生影响，仅使荧光强度降低，且降低程度与一定范围内加入的亚硝酸盐的量呈良好的线性关系，见图2。

图2 同步荧光猝灭光谱Fig.2 Synchronous fluorescent quenching spectra

注：1为罗丹明6G+HCl+KBrO3；2为罗丹明6G+HCl+KBrO3+NO2-。

2.2 恒波长Δλ的选择

在同步扫描过程中，选择适当的Δλ值很重要，它直接影响测定方法的灵敏度与选择性，为了选择适合的Δλ值，分别实验了Δλ值为10，15，20，25，30 nm对样品的同步荧光强度的影响，结果见图3。在Δλ=25 nm时，得到同步荧光信号最强、半宽峰最窄的单峰同步荧光光谱。

图3 不同Δλ时的同步荧光强度Fig.3 Synchronous fluorescence intensity at different Δλ

2.3 酸性介质

选定HCl的用量为1，3，5，7，9 mL。随着HCl用量的增大，ΔF 先增加再下降。当HCl用量为5 mL时，ΔF有最佳实验效果，见图4。故选择HCl用量为5 mL。

图4 HCl用量的影响Fig.4 Effect of HCl dosage

2.4 罗丹明6G的影响

选定罗丹明6G的用量为0.5，1.0，1.2，1.5，1.8 mL，实验结果见图5。

图5 罗丹明6G用量的影响Fig.5 Effect of rhodamine 6G dosage

随着罗丹明6G用量的增大，ΔF先增加后下降。当罗丹明6G用量为1.0 mL时，ΔF有最佳实验效果。罗丹明6G的用量不足时，空白同步荧光值偏低，导致ΔF偏小，如果罗丹明6G过量，空白荧光强度很强，加入亚硝酸根使罗丹明6G的荧光强度猝灭程度不高，灵敏度不高，导致ΔF降低。故选择罗丹明6G用量为1.0 mL。

2.5 溴酸钾的影响

选定溴酸钾的用量为1.0，2.0，3.0，4.0，5.0 mL，实验结果见表1。

表1 溴酸钾用量的影响Table 1 Effect of potassium bromate dosage

随着溴酸钾用量的增大，ΔF一直增加。当溴酸钾用量大于1.0 mL时，F值很低，说明随着溴酸钾量的不断增大，空白体系加入亚硝酸根后荧光强度下降过多，灵敏度太高，不稳定，在此不做考虑，因此选取溴酸钾用量为1.0 mL。

2.6 稳定性探讨

分别测试了尿素1，2，3 mL在1 h的稳定性。实验发现加入尿素的量为3 mL时ΔF稳定性最强，因而选用3 mL在1 h内完成实验。

2.7 反应温度与反应时间

实验了温度在25～65 ℃之间对体系ΔF的影响，在55 ℃时，ΔF达到最大值，因而选定55 ℃进行进一步的研究。改变时间测定ΔF，发现反应时间为9 min时，ΔF有最大值，因此本实验选择反应时间为9 min。

2.8 线性范围及检出限

在选定的最佳实验条件下，改变亚硝酸根加入量，测定亚硝酸根浓度与ΔF的关系，见图6。

图6 标准曲线Fig.6 Standard curve

实验发现亚硝酸根在2～36μg/L范围内与ΔF有良好的线性关系，其线性回归方程为ΔF=19.018-17.164(R2=0.9986)，对10份空白溶液进行平行测定，得到方法的检出限CL=3S0/K，CNO2-为0.68μg/L。

2.9 共存离子

考察了6种离子对5 mL 0.1 μg/mL亚硝酸根的影响。当测量相对误差<±5%时，160倍的Cl-，150倍的SO42-，100倍的Ca2+，Na+，K+，50倍的Mg2+，在本实验条件下不会对实验造成干扰。

3 样品分析

香肠按文献[12]进行处理，取滤液2.00 mL，按实验方法测定并同时做空白试验，并做标准加入回收实验，结果见表2和表3。

表2 火腿肠中亚硝酸根的测定Table 2 Determination of nitrite in sausage

表3 回收率的测定(n=3)Table 3 Determination of recoveries(n=3)

本文采用恒波长同步荧光猝灭法测定食品中亚硝酸根的含量，该方法重现性和选择性较高，简单快捷，用于测定食品中亚硝酸根的含量，能得到满意的结果。

[1]Sindelar J J, Milkowsk A L. Human safety controversies surrounding nitrate and nitrite in the diet[J]. Nitric Oxide,2012,26(4):259-266.

[2]GB 2760-2007，食品添加剂使用卫生标准[S].

[3]国家环保局《水和废水监测分析方法》编委会.水和废水监测分析方法(第三版)[M].北京:中国环境科学出版社,1998：260-263.

[4]唐宏武,罗庆尧.铁氰化钾-NO2-鲁米诺化学发光体系测定痕量亚硝酸盐的研究[J].高等学校化学学报,1994,25(11):1626-1628.

[5]窦宪民,高歧,石焱.偶合化学发光法测定环境水样中的痕量亚硝酸根[J].分析实验室,2000,21(3):43-45.

[6]冯素玲,唐安娜,樊静.荧光分析法测定痕量亚硝酸根[J].分析实验室,2001,20(2):41-43.

[7]曹连城,邓泳南.催化荧光光度法测定痕量亚硝酸根[J].武汉化工学院学报,2001,23(4):19-20.

[8]李岚,刘金燕.恒波长同步荧光猝灭法测定痕量亚硝酸根[J].中国食品添加剂,2016(2):146-149.

[9]冯素玲,程定玺,张桂恩.催化荧光法测定痕量亚硝酸根[J].河南师范大学学报,1997(1):51-55.

[10]高甲友,盛永章.催化荧光法测定痕量亚硝酸根和硝酸根[J].理化检验-化学分册,1994(9):159-162.

[11]杨利,潘可亮,李树伟,等.恒波长同步荧光猝灭法测定饮用水中微量溴酸根[J].分析试验室,2010(7):46-48.

[12]梁宇,李睿,樊静.食品中亚硝酸根的荧光动力学分析法[J].河南师范大学学报(自然科学版),2013,41(4):77-80.

Determination of Trace Nitrite by Constant-wavelength SynchronousFluorescent Quenching Method

LI Lan, HAO Hong-qing, LIN Jia-sen

(School of Chemistry and Environment, Jiaying University, Meizhou 514015, China)

The constant-wavelength synchronous fluorescent quenching method is established for determination of trace nitrite. In HCl media (Δλ=25 nm), constant-wavelength synchronous fluorescence of rhodamine 6G can be quenched because nitrite is used as catalyst for the oxidation of rhodamine 6G with bromate ion, and the linear relationship is developed between the extent of quenching and the content of nitrite. The detection limit for nitrite is 0.68 μg/L with the linear range of 2～36 μg/L. The method can be used to determine trace NO2-in sausage with satisfactory results.

constant-wavelength synchronous fluorescent quenching method；rhodamine 6G；nitrite；bromate ion

2017-02-19

广东省高校优秀青年教师培养计划项目(102B0102)；嘉应学院育苗工程(314E22)

李岚(1983- )，女，广东梅州人，硕士，研究方向：分子荧光分析。

TS207.3

A

10.3969/j.issn.1000-9973.2017.08.026

1000-9973(2017)08-0120-03