SOX4对非小细胞肺癌细胞A549的顺铂耐药作用的影响

李维 刘旭 张国倩 张琳琳

肺癌是近年来全球范围内发病率和死亡率最高的恶性肿瘤之一，其发病率和死亡率近年来也明显上升[1,2]。肺癌中约85%为非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer,NSCLC）[3]，其发病率在肺癌中居首位[4]，患者5年内生存率不足15%[5]。以顺铂（DDP）为主的联合化疗是目前治疗晚期NSCLC的标准方案，但目前部分患者对顺铂耐受是导致化疗失败的主要原因[6]。因此，对顺铂耐药的分子机制的研究对NSCLC的防治和提高疗效具有深远意义。SOX4是转录调控分子家族SOX重要成员，研究表明，SOX4在多种肿瘤的发生发展过程中发挥着重要的作用,机制之一可能是其通过调控β-catenin的表达对Wnt信号通路进行调控[7]，而β-catenin在NSCLC细胞对顺铂的耐受中起着重要作用[8]。因此，本研究旨在研究SOX4对小细胞肺癌细胞A549的顺铂耐药作用及其分子机制。

1 材料与方法

1.1 材料 1640培养基、小牛血清购于美国HyClone公司。顺铂（DDP）为齐鲁制药厂生产。SOX4的siRNA购自QIAGEN公司。SOX4、β-catenin和Survivin抗体购自Abcam公司。免疫印迹化学发光系统购自Syngene公司。MTT购自Sigma公司。Trizol、SYBR和Lipo2000购自美国Invitrogen公司。RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit购自加拿大Fermentas公司。肺癌细胞株A549由本实验室保存。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 肺癌细胞A549培养于含10%FBS的1640培养基中，培养液含青霉素/链霉素100 U/mL，将细胞置于37oC、5%CO2培养箱中培养。

1.2.2 体外诱导法建立顺铂耐药的肺癌细胞株A549/DDP对数生长期A549细胞在含有0.1 μM顺铂的1640培养基培养4周后，将细胞消化传代用正常培养基培养，待细胞贴壁后，将顺铂浓度提高至0.2 μM，培养4周；再依次将药物浓度提高到0.4 μM、0.6 μM、0.8 μM、1 μM……2 μM培养。在2 μM浓度下维持培养，初步得到A549/DDP细胞。

1.2.3 A549细胞与耐药A549/DDP细胞细胞生长曲线测定取对数生长期的A549细胞和耐药A549/DDP细胞，以5×103个/孔接种于24孔板中，100 μL/孔，37oC、5%CO2培养，分别于24 h、48 h、72 h、96 h和120 h胰酶消化，对细胞进行计数，每组3个复孔，每孔计数3次，取平均值绘制细胞生长曲线。

1.2.4 CCK8检测A549及A549/DDP细胞对顺铂耐药性 取对数生长期的A549细胞和耐药A549/DDP细胞，以0.3×105个/mL接种于96孔板中，100 μL/孔，37oC、5%CO2培养。20 h后，加入梯度浓度的顺铂处理，每组设置3个复孔，培养48 h后，将旧培养基吸去，置换含10%CCK-8的新鲜培养基，37oC、5%CO2继续培养，3 h后，测450 nm吸光度值，计算半抑制浓度（half maximal inhibitory concentration, IC50）。

1.2.5 A549/DDP细胞SOX4 siRNA转染 取对数生长期的A549/DDP细胞，以1×106个/mL接种于六孔板中，1 mL/孔，37oC、5%CO2培养。24 h后用Lipo2000将SOX4的两条siRNA以及siRNA con转染A549/DDP细胞中，转染48 h后检测A549/DDP细胞对顺铂半数抑制浓度IC50，方法同1.2.4。

1.2.6 实时荧光定量PCR检测mRNA表达水平 用Trizol法提取非小细胞肺癌细胞A549/DDP的总RNA，利用RevertAid First逆转录试剂盒得到cDNA，以cDNA为模板，分别以SOX4、β-catenin及Survivin实时定量PCR引物进行RT-PCR反应。SOX4引物：上游引物：5’-GGCCTG TTTCGCTGTCGGGTC-3’；下游引物：5’-GCCTGCATG CAACAGACTGGCA-3’；β-catenin引物：上游引物：5’-T GGTGCCCAGGGAGAACCC-3’；下游引物；5’-GTCAG CACCAGGGTGGTGGCA-3’；Survivin引物：上游引物：5’-TGGCCCAGTGTTTCTTCTGCTTCA-3’；下游引物：5’-AAAGGAAAGCGCAACCGGACGAAT-3’；内参GAPDH引物：上游引物：5’- GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3’；下游引物：5’-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3’。实验重复3次。

1.2.7 Western blot检测蛋白表达 水平收集细胞，用细胞裂解液RIPA裂解提取总蛋白。SDS-PAGE凝胶电泳分离，恒流300 mA转移至PVDF印迹膜。5%脱脂牛奶封闭1 h后，加入一抗，4oC孵育过夜。次日PBST洗膜，二抗室温孵育1 h。用化学发光法显色，凝胶成像系统采集成像。

1.3 统计学分析 应用SPSS 17.0软件进行统计学处理，结果用Mean±SD描述，组间比较应用t检验，以P＜0.05为有统计学差异。

2 结果

2.1 A549及A549/DDP细胞对顺铂耐药性 本研究检测了A549/DDP细胞及其亲本细胞A549对顺铂的半数抑制浓度IC50，结果如图1所示，A549/DDP细胞对顺铂耐药性显著增强，A549/DDP和A549细胞的IC50分别为（27.87±0.92）μM和（2.04±0.37）μM，两者具有显著差异（P＜0.001）。耐药细胞株对顺铂耐药性增加了13.7倍。

2.2 A549细胞与耐药A549/DDP细胞生长曲线比较 为验证构建顺铂耐药细胞株对A549细胞增殖的影响，本研究首先检测了A549细胞与耐药细胞株A549/DDP的生长曲线，如图2显示，耐药A549/DDP细胞增值速度与其亲本细胞A549增殖速度几乎相同，曲线无显著差异（P＞0.05），说明构建耐药顺铂细胞株后未影响细胞的增殖能力。

2.3 A549和A549/DDP细胞中SOX4的表达 为验证SOX4与NSCLC细胞A549顺铂耐药的关系，本研究检测了耐药细胞株中SOX4蛋白的表达，结果如图3显示，构建的耐药细胞株A549/DDP中SOX4的表达明显上调（P＜0.001），提示SOX4可能在NSCLC细胞耐药过程中发挥作用。

2.4 敲减A549/DDP细胞中SOX4的表达对细胞耐药性的影响 为验证SOX4对NSCLC细胞A549顺铂耐药的影响，本研究在敲减SOX4后用CCK8法检测了A549/DDP细胞对顺铂的耐药性。结果如图4显示，与转染对照siRNA con细胞比，siRNA转染在转录水平和蛋白表达水平均显著抑制了SOX4的表达（P＜0.001），而A549中SOX4的表达也较A549/DDP显著降低（P＜0.01）。通过细胞对于顺铂耐药性结果显示，敲减SOX4后，细胞对顺铂耐药性显著降低（P＜0.001），且在SOX4低表达的A549中，对于顺铂的耐药性同敲减了SOX4后耐药性相似。A549、A549/DDP、siRNA con、siRNA-1、siRNA-2的IC50分别为（1.98±0.24）、（28.17±4.36）、（26.57±6.21）、（0.87±0.28）、（0.92±0.57）。

2.5 敲减SOX4对Wnt信号通路相关蛋白表达的影响 为探索SOX4对NSCLC细胞对顺铂耐药性的分子机制，本研究检测了敲减SOX4后Wnt信号通路关键蛋白β-catenin及其下游靶基因Survivin的mRNA和蛋白表达情况，结果如图5所示，敲减SOX4后，A549/DDP细胞内β-catenin及Survivin的mRNA水平显著降低（P＜0.01），同时Western blot结果显示两种蛋白的表达显著降低。该结果显示SOX4影响了β-catenin与Survivin蛋白的表达，可能与细胞对于顺铂耐药性改变的因素。

3 讨论

图 1 A549细胞与A549/DDP细胞对顺铂的耐药性Fig 1 The resistance of A549 cells and A549/DDP cells to cisplatin

图 2 A549细胞与A549／DDP的细胞生长曲线Fig 2 Cell growth curve of A549 cells and A549 / DDP

图 3 SOX4在A549与A549/DDP细胞中的表达Fig 3 Expression of SOX4 in A549 and A549/DDP cells

图 4 敲减SOX4后A549/DDP细胞对顺铂的耐药性。A：敲减SOX4后，实时定量PCR检测SOX4 mRNA表达水平；B：敲减SOX4后，Western bot检测蛋白表达水平；C：检测A549及不同敲减SOX4的A549/DDP细胞对顺铂的耐药性。Fig 4 Resistance of A549/DDP cells to cisplatin after knockdown of SOX4. A: Expression level of SOX4 mRNA of A549/DDP after knockdown of SOX4 was detected by real-time quantitative PCR; B: The expression level of SOX4 of A549/DDP after knockdown of SOX4 was detected by Western blot; C:Resistance of A549 and A549/DDP cells to cisplatin.

图 5 敲减SOX4后对β-catenin和Survivin表达的影响。A：敲减SOX4后，实时定量PCR检测β-catenin和Survivin mRNA表达水平；B：敲减SOX4后，Western blot检测β-catenin和Survivin蛋白表达。Fig 4 Expression of β-catenin and Survivin of A549/DDP after knockdown of SOX4. A: Expression level of β-catenin mRNA and Survivin mRNA of A549/DDP after knockdown of SOX4 was detected by real-time quantitative PCR; B: Expression of β-catenin and Survivin of A549/DDP after knockdown of SOX4 was detected by Western blot.

肺癌是目前全球范围内恶性肿瘤之一，NSCLC是最常见的肺癌类型，也是肺癌治疗的重点[9]，化疗是重要的临床治疗手段，以顺铂（DDP）为主的联合化疗也是目前治疗晚期NSCLC的标准方案，对顺铂耐受是导致化疗失败的主要原因。因此，本研究首先构建了顺铂耐药细胞株A549/DDP作为研究模型，探究NSCLC对顺铂的耐药机制。

研究[10,11]表明，SOX4在多种癌症中均有异常表达，其表达的增加可作为乳腺癌和NSCLC患者不良预后的生物标志物，并在一定程度上影响了相关肿瘤细胞对药物的敏感性。但SOX4与NSCLC对顺铂耐药性的影响目前无相关报道。本研究发现，顺铂耐药细胞株A549/DDP中SOX4蛋白的表达水平显著高于其亲本A549细胞，并且siRNA敲减SOX4的表达后，A549/DDP细胞的耐药性显著降低，说明SOX4对NSCLC细胞对顺铂的耐药性有重要的调控作用，提示SOX4可作为增加NSCLC顺铂敏感性的重要靶点。

WNT/β-catenin信号通路在肿瘤发生发展过程中有重要的调控作用，Wnt信号通路的异常与多种肿瘤化疗耐受密切相关[12,13]。研究表明，SOX4能够通过Wnt/β-catenin信号通路影响黑色素瘤细胞的增殖[14]，并且，Wnt信号通路下游靶分子Survivin与肿瘤抗药相关，其siRNA可能作为克服肿瘤抗药的新型治疗手段[15]。本研究发现，在耐药细胞株中干扰SOX4的表达后，Wnt信号通路关键蛋白β-catenin及其下游靶分子Survivin的蛋白表达水平显著降低。由此推测，SOX4可能通过Wnt信号通路中β-catenin的表达进而调节其下游靶分子Survivin从而介导A549/DDP细胞对顺铂耐药。

综上所述，本研究利用顺铂诱导构建耐药细胞株A549/DDP，发现其SOX4的蛋白表达水平显著高于亲本细胞，进一步研究表明，敲减SOX4后，A549/DDP细胞耐药性显著降低，且Wnt信号通路关键蛋白β-catenin及其下游靶分子Survivin的蛋白表达水平显著降低，推测SOX4可能通过调节Wnt信号通路影响NSCLC的敏感性，具体分子机制还有待进一步研究，能否将SOX4作为克服NSCLC耐药的新靶点也有待进一步的探索。