非小细胞肺癌组织中HHLA2表达变化及其意义

刘春，邓述恺

(1达州市中心医院，四川达州 635000；2西南医科大学附属第一医院)

非小细胞肺癌组织中HHLA2表达变化及其意义

刘春1，邓述恺2

(1达州市中心医院，四川达州 635000；2西南医科大学附属第一医院)

目的 观察非小细胞肺癌(NSCLC)组织中人内源性逆转录病毒-H-长末端重复关联蛋白2(HHLA2)的表达变化，并探讨其意义。方法 NSCLC组织60例份(肿瘤组)，癌旁组织(至少距肿瘤边缘5 cm以上)30例份(癌旁组)，采用免疫组化En Vision法检测两组HHLA2，分析HHLA2表达与NSCLC临床病理参数的关系。结果 肿瘤组及癌旁组HHLA2阳性率分别为81.67%、13.33%，两组比较，P<0.05。HHLA2表达与NSCLC患者性别、年龄、吸烟情况、病理类型、临床分期、淋巴结转移均无相关性(P均>0.05)。结论 NSCLC组织中HHLA2表达升高，其表达与NSCLC临床病理参数均无相关性；HHLA2可能成为NSCLC免疫检查及治疗的新靶点。

人内源性逆转录病毒-H-长末端重复关联蛋白2；非小细胞肺癌；免疫组织化学

肺癌按组织病理学分为小细胞肺癌(SCLC)和非小细胞肺癌(NSCLC)，NSCLC占肺癌的比例约85%。免疫逃逸和肿瘤微环境是肿瘤发生发展的重要原因之一，在手术、放疗、化疗等传统综合治疗基础上，免疫治疗已取得重要进展，CTLA-4、PD-1通路在肺癌等恶性肿瘤中已表现出良好的疗效[1]，Nivolumab已被FDA批准用于鳞状NSCLC的治疗[2]。人内源性逆转录病毒-H-长末端重复关联蛋白2(HHLA2)为B7家族新成员[3]，同时也被称为B7-H7、B7-H5、B7y，为T细胞共抑制分子，在NSCLC等多种实体恶性肿瘤组织中呈高表达。研究[4]发现，HHLA2与NSCLC的EGFR基因突变及肺腺癌的淋巴结转移存在相关性。HHLA2的免疫调控机制在NSCLC的发生发展过程中发挥重要作用，有可能成为免疫检查及治疗新靶点。本研究采用免疫组化法检测NSCLC组织中HHLA2表达，分析其与NSCLC临床病理参数的关系，旨在为NSCLC的免疫检查及治疗寻找新的免疫靶点提供一定的科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料 选取西南医科大学附属第一医院病理科2015年1～12月保存的NSCLC标本60例份(肿瘤组)，所有标本均经病理证实。患者男42例，女18例；年龄≥60岁25例，<60岁35例；有吸烟史29例，无吸烟史31例；病理类型为鳞癌30例，腺癌30例；临床分期Ⅰ期+Ⅱ期39例，Ⅲ期+Ⅳ期21例；无淋巴结转移35例，有淋巴结转移25例。无其他肺部疾病及其他组织、器官的恶性肿瘤，术前未行化疗、放疗、免疫治疗及其他针对恶性肿瘤的治疗。另选30例份癌旁组织(至少距肿瘤边缘5 cm以上)作对照(癌旁组)。

1.2 组织HHLA2检测方法 使用型号为RM2235的德国LEICA转轮式切片机分别切取厚度为4 μm的NSCLC、癌旁肺组织蜡块各3张，其中2张用于本次实验行免疫组化染色，剩下1张用于HE染色以核实诊断。免疫组化采用En Vision法，常规烤片、脱蜡，脱苯、内源性过氧化物酶灭活、修复抗原、加一抗、加二抗、显色、复染、分化、梯度酒精脱水、透明、封片、镜检。以PBS代替一抗为阴性对照。染色结果判断：HHLA2主要定位于细胞膜和细胞质，出现棕黄色或黄色颗粒定义为阳性细胞。参照文献[5]方法，免疫组化结果采用半定量法进行分析，染色强度×阳性细胞百分比=免疫反应评分。随机在高倍显微镜(×400)下取10个视野，取其均值，计算染色阳性的肿瘤细胞占视野内所有肿瘤细胞的百分比，0=0～10%染色，1=11%～25%，2=26%～50%，3=51%～75%，4=76%～100%；根据细胞膜和细胞质的染色强度进行评分：未见显色的评为0分，显色强度为浅黄色计1分，棕黄色计2分，棕褐色计3分；将两项指标的得分相乘，按照得分结果进行判定：0分为阴性(-)，1分为弱阳性(+)，2分为中等阳性(++)，≥3分为强阳性(+++)。评分时避开肿瘤坏死区域和肿瘤边缘部分，评分只包括肿瘤细胞，肿瘤间质细胞不作计数。在本次研究中，将得分为1分及以上的按阳性表达计算。

1.3 统计学方法 采用SPSS19.0统计软件。采用χ2检验对HHLA2的阳性表达率、HHLA2与NSCLC临床病理参数的关系进行分析比较。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组HHLA2表达比较 肿瘤组及癌旁组HHLA2阳性率分别为81.67%、13.33%，两组比较，P<0.05。

2.2 HHLA2表达与NSCLC临床病理参数的关系 结果见表1。由表1可知，HHLA2表达与NSCLC患者性别、年龄、吸烟情况、病理类型、临床分期、淋巴结转移均无相关性(P均>0.05)。

表1 HHLA2表达与 NSCLC临床病理参数的关系

3 讨论

原发性支气管肺癌是临床常见的恶性肿瘤之一，在全球范围内发病率和病死率均呈上升趋势。据世界卫生组织国际癌症研究署(IARC)2010年报告显示，2008年全球肺癌新发病例约161万例，占恶性肿瘤新发病例数的13%，居恶性肿瘤首位，而死亡约138万例，占恶性肿瘤死亡病例数的18%。按组织病理学，肺癌分为SCLC和NSCLC，而NSCLC是肺癌中最常见的组织学类型，占比约为85%。

HHLA2为近年发现的B7家族新成员[4]，同时也被称为B7-H7、B7-H5、B7y，为T细胞共抑制分子，位于人类基因染色体3q13.13区，是一个由含有414个氨基酸的开放阅读框及3个胞外免疫球蛋白超家族结构域所组成的Ⅰ型跨膜蛋白，与B7家族的其他成员有显著同源性[5,6]。HHLA2作为T细胞的负性共刺激分子，广泛表达于人抗原呈递细胞和T细胞。

肺癌属免疫原性肿瘤，共抑制分子在NSCLC组织的表达代表肿瘤免疫逃逸机制之一[6]。有效的抗肿瘤免疫治疗需要成功激活T淋巴细胞，而T细胞激活则需要双重信号的协同作用，一是主要组织相容性复合体，另一个是协同刺激信号。而B7家族共信号分子为协同刺激信号的主要来源，其主要成员包括PD-L1(B7-H1)、B7-H2、B7-H3、B7-H4、B7-H6、HHLA2(B7-H7)[7,8]。HHLA2作为T细胞的负性共刺激分子，其导致肿瘤的发生可能存在以下几种机制：①在T细胞受体信号传导作用下，抑制CD4+、CD8+T细胞的增殖功能，导致肿瘤细胞逃避细胞毒性T细胞的杀伤活性，减弱机体的抗肿瘤免疫应答，从而促使肿瘤免疫逃逸[9,10]；②在多种炎症因子刺激作用下，激活树突状细胞和巨噬细胞中静息状态的HHLA2，诱导肿瘤抗原特异性T细胞凋亡，降低肿瘤微环境中T细胞免疫效应，介导肿瘤的免疫逃逸[11]；③HHLA2可以通过与其受体TMIGD2结合后激活磷酸肌醇3-激酶和丝氨酸-苏氨酸激酶AKT依赖性信号级联途径，抑制细胞周期相关蛋白表达和基因转录，阻碍细胞周期进展，抑制T细胞增殖，从而导致肿瘤的发生[12]；④当HHLA2和TMIGD2结合后在血管生成期间起到减少细胞迁移和促进毛细血管形成的作用，HHLA2-TMIGD2途径可能对提高肿瘤血管内皮生成发挥重要作用[13]。

TMIGD2为HHLA2的特异性受体，主要存在于内皮细胞和上皮细胞，参与体内多种免疫反应，在T细胞、B细胞、单核细胞、树突状细胞均可发现，但TMIGD2主要表达于幼稚T细胞和自然杀伤细胞，在抗原呈递细胞中不表达。据研究[4,14]，HHLA2除在胎盘、肾脏、肠、胆囊、乳腺外的大多数人类正常组织中不表达外，其在包括肺癌、黑色素瘤、食管癌等多种恶性肿瘤组织中均呈高表达，这种在恶性肿瘤中广泛表达表明HHLA2可能在肿瘤进展的关键步骤发挥作用。而Cheng等[6]发现，HHLA2在NSCLC的高表达和EGFR基因突变存在相关性，因此阻断HHLA2-TMIGD2途径使NSCLC进行免疫治疗成为可能。但是，HHLA2与其受体TMIGD2结合的相关机制及信号通路目前尚未明确，需进一步研究。

本研究显示，肿瘤组NSCLC阳性率高于癌旁组，提示HHLA2可能在NSCLC的发生发展过程中发挥着重要作用，可能成为NSCLC免疫检查及治疗的新靶点。本研究还发现，HHLA2表达与NSCLC患者性别、年龄、吸烟情况、病理类型、临床分期、淋巴结转移均无相关性，提示该结果可能由于样本量少，需继续深入研究HHLA2在肿瘤中的表达及作用机制，探讨HHLA2及特异性受体TMIGD2参与的信号通路在NSCLC的发生发展过程中的作用，为HHLA2可能成为免疫检查及治疗的新靶点提供依据。

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邓述恺(E-mail:dsk-lan@163.com)

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1002-266X(2017)31-0064-03

2017-06-11)