糖尿病肾脏疾病患者血清miR-16-5p水平变化及其意义

张琳，唐平易，周俊，刘立亚，唐东兴

(1南华大学附属第二医院，湖南衡阳 421001；2衡阳市中医医院(南院)；3湖南医药学院)

糖尿病肾脏疾病患者血清miR-16-5p水平变化及其意义

张琳1，唐平易2，周俊1，刘立亚3，唐东兴1

(1南华大学附属第二医院，湖南衡阳 421001；2衡阳市中医医院(南院)；3湖南医药学院)

目的 观察糖尿病肾脏疾病(DKD)患者血清微小RNA-16-5p(miR-16-5p)的水平变化，并探讨其意义。方法 DKD患者53例(观察组)，其中尿蛋白正常者16例、DKD Ⅲ期者19例、Ⅳ期者12例、Ⅴ期者6例，另选50例健康体检者作为对照组。采用实时荧光定量PCR技术检测血清miR-16-5p，ROC曲线分析血清miR-16-5p水平对DKD的诊断价值，Pearson相关分析法分析其与空腹血糖(FPG)、糖化血红蛋白(HbA1c)、尿白蛋白/肌酐比值(UACR)、24 h尿白蛋白量的相关性。结果 观察组及对照组血清miR-16-5p水平分别为0.45±0.25、1.00±0.30，两组比较，P<0.01。观察组尿蛋白正常者及DKD Ⅲ期、Ⅳ期、Ⅴ期者血清miR-16-5p水平分别为0.65±0.29、0.32±0.22、0.30±0.16、0.48±0.12，尿蛋白正常者、DKDⅤ期者与DKDⅢ期者、Ⅳ期者比较，P均<0.05。血清miR-16-5p水平预测DKD的ROC曲线下面积为0.931(95%CI：0.883～0.980)，以miR-16-5p水平0.665为截断点，其诊断DKD的灵敏度为86.0%、特异度为88.7%。观察组血清miR-16-5p与FPG、HbA1c、UACR、24 h尿白蛋白量均呈负相关(r分别为-0.71、-0.43、-0.53、-0.72，P均<0.01)。结论 DKD患者血清miR-16-5p水平降低，且随病情严重程度变化而变化，检测此指标有助于DKD的诊断及病情严重程度判断。

糖尿病；糖尿病肾脏疾病；微小RNA-16-5p

糖尿病肾脏疾病(DKD)是糖尿病患者最常见且最严重的慢性并发症之一，如未能有效控制，疾病发展到中后期肾功能将呈进行性下降。目前，DKD已成为发达国家终末期肾脏病(ESRD)的首要原因。DKD在我国的比率也日益升高，约占ESRD病因的16.4%[1]。微小RNA(miRNA)是长约21～25个核苷酸的高度保守的内源性非编码单链RNA分子，主要参与基因转录后水平的调控。miRNA通过与靶mRNA结合，诱导mRNA降解，从而导致翻译抑制，影响靶mRNA的表达。目前发现miRNA有一个庞大的小分子调控RNA家族，它们参与机体生长、发育、衰老及疾病的发生发展过程[2,3]。越来越多的研究发现，miRNA是慢性肾脏疾病病情进展的重要生物学标记[4,5]，其异常表达参与DKD的发病[6]。miR-16-5p与糖尿病高血糖、高胰岛素及胰岛素抵抗密切相关[7,8]，然而其在DKD患者血清中的表达情况及其与肾脏病情的相关性目前鲜有报道。本研究观察了DKD患者血清miR-16-5p的水平变化，并探讨其意义。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取2016年6～9月南华大学附属第二医院收治的DKD患者53例(观察组)，男31例，女22例；年龄46～76(54.2±7.2)岁；尿蛋白正常者(病程超过10年无DKD及DKD Ⅰ～Ⅱ期)16例、DKD Ⅲ期者19例、DKD Ⅳ期者12例、DKD Ⅴ期者6例；BMI(25.2±3.4)kg/m2；血压(124±22)/(80±12)mmHg。DKD的诊断标准和临床分期标准参考DKD Mogensen分期标准和中华医学会制定的《中国2型糖尿病防治指南(2013版)》。排除标准：并发其他急慢性肾病，严重血液、心、肺、肝、神经系统疾病者，急慢性感染、器官移植、肿瘤、自身免疫性疾病者。另选取同期健康体检者50例作为对照组，男30例，女20例；年龄43～72(55.7±6.7)岁；BMI(24.8±3.5)kg/m2；血压(119±20)/(78±11)mmHg。本研究征得所有研究受试者本人知情同意并签署知情同意书。

1.2 观察方法 ①miR-16-5p：受试者均于早晨空腹采用普通生化管抽取肘静脉血3 mL，3 000 r/min离心10 min，取1 mL血清用于miR-16-5p检测。使用TRIzol试剂盒(美国Invitrogen公司)提取总RNA。运用实时荧光定量PCR法检测miR-16-5p。按照miR-16-5p序列5′-UAGCAGCACGUAAAUAU-UGGCG-3′设计逆转录茎环引物：5′-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGA-

CCGCCAA-3′。PCR上游引物：5′-CTCGCTAGCAG-CACGTAAATA-3′，下游引物：5′-TCCAGTGCAGGGT-CCGAGGT-3′。以Cel-39为内参，内参引物及PCR条件参考文献[9]报道。Rever Tra Ace®逆转录试剂盒(日本Toyobo公司)逆转录RNA，PCR使用SYBR®Premix Ex TaqTM试剂盒(大连Takara公司)在实时定量PCR仪(美国ABI公司)上进行，操作严格按照产品说明书进行。采用2-ΔΔCT法计算miR-16-5p相对表达量。②空腹血糖(FPG)：于早晨空腹采用普通生化管抽取肘静脉血2 mL，以3 000 r/min离心10 min分离血清，采用己糖激酶法测定FPG。③糖化血红蛋白(HbA1c)：于早晨空腹采用乙二胺四乙酸二钾抗凝试管抽取肘静脉血2 mL，运用测定仪检测HbA1c。④尿白蛋白/肌酐比值(UACR)、24 h尿白蛋白量：所有受试者均在排除发热、剧烈运动、显著高血压状态等可能引起尿蛋白排泄增加的情况下，收集24 h内所有尿液标本，即将早晨6点至次日早晨6点的混合尿定义为24 h尿，将该天中任意一段时间点留取的尿液定义为随机尿。留取随机尿、24 h尿，吸取混匀尿液2～3 mL，以3 000 r/min离心10 min，取上清液。使用日立7600全自动生化分析仪，采用免疫比浊法测定尿白蛋白，采用碱性苦味酸法测定尿肌酐，计算UACR，UACR=尿白蛋白(mg)/尿肌酐(g)；以上指标所用试剂、标准品和质控品均由北京利德曼生化技术有限公司提供。

2 结果

2.1 两组血清miR-16-5p水平比较 观察组及对照组血清miR-16-5p水平分别为0.45±0.25、1.00±0.30，两组比较，P<0.01。观察组尿蛋白正常及DKD Ⅲ期、Ⅳ期、Ⅴ期者血清miR-16-5p水平分别为0.65±0.29、0.32±0.22、0.30±0.16、0.48±0.12，尿蛋白正常者、DKDⅤ期者与DKDⅢ期者、Ⅳ期者比较，P均<0.05。

2.2 血清miR-16-5p水平预测DKD的ROC曲线分析 血清miR-16-5p水平预测DKD的ROC曲线下面积为0.931(95%CI：0.883～0.980)，以miR-16-5p水平0.665为截断点，其诊断DKD的灵敏度为86.0%、特异度为88.7%。

2.3 观察组血清miR-16-5p与FPG、HbA1c、UACR、24 h尿白蛋白量的相关性分析 两组FPG、HbA1c、UACR、24 h尿白蛋白量比较见表1。观察组血清miR-16-5p与FPG、HbA1c、UACR、24 h尿白蛋白量均呈负相关(r分别为-0.71、-0.43、-0.53、-0.72，P均<0.01)。

表1 两组FPG、HbA1c、UACR、24 h尿白蛋白量比较

注：与对照组比较，*P<0.05，△P<0.01。

3 讨论

DKD是由糖尿病引起的慢性肾病，具有发病率高、预后不良的特点，高血糖是导致慢性肾病发生与发展的重要原因[10]。然而，高血糖导致慢性肾病发生与进展的分子机制目前尚不完全清楚。有研究[4,5]表明，miRNA靶向调控靶基因转录后水平表达是表观遗传学调控的重要方式，异常表达的miRNA参与DKD发生发展。明确与DKD发病相关的特异度miRNA及可能机制，将有利于DKD的早期诊断和靶向干预治疗。近年研究[6]发现，多种miRNA如miR-375、miR-9、miR-204/211等都参与了DKD的发病，并伴有血清中表达量变化，将可能作为DKD的生物标志物。

文献[7,8]报道，血糖增高导致患者miR-16-5p表达明显下调。然而，miR-16-5p低表达是否与DKD患者肾脏病情相关，目前尚未见相关报道。本研究发现，观察组患者血清miR-16-5p水平低于健康对照。进一步分析观察组中不同亚组患者miR-16-5p的表达情况发现，DKDⅢ期、Ⅳ期者miR-16-5p水平低于尿蛋白正常及DKD Ⅴ期者。这表明miR-16-5p可能不仅参与DKD早期的发生，在中晚期病程进展中还可能起着非常重要的作用。另本研究还发现，以血清miR-16-5p水平0.665为截断点，其诊断DKD的灵敏度为86.0%、特异度为88.7%。因此，初步推测血清miR-16-5p可以作为诊断DKD患者的生物学指标。

以血糖升高为始因并糖代谢紊乱参与始终的DKD患者存在明显miR-16-5p低表达。本研究证实，血清miR-16-5p水平与FPG、HbA1c水平均呈负相关，这与先前的研究[7,8]结果一致。根据DKD Mogensen分期标准，微量蛋白尿的出现被认为是临床早期诊断DKD的主要线索，它不仅反映了肾脏的损害，还是全身血管内皮损害的显著标志。DKD一旦出现明显的蛋白尿，进入Ⅲ期、Ⅳ期，其进程常难以逆转。病程进展关键时期，如得不到有效治疗，50%患者7年内可发展为终末期肾病[11]。UACR和24 h尿白蛋白量检测是临床常用的协助DKD分期诊断的重要指标。本研究发现，miR-16-5p水平与UACR、24 h尿白蛋白量呈负相关，提示miR-16-5p的表达下调与DKD肾损害密切相关，可能参与肾损伤的发生发展。

DKD发病机制复杂[12]，其特异性病理改变是结节性肾小球硬化，本质是常见而难治的微血管并发症合并灶状肾小管萎缩和肾间质纤维化。而血管内皮功能障碍是微血管病变的主要发病机理之一。血管内皮细胞的功能维持是重建血管完整性和维持组织灌注的基础。通过文献分析发现，miR-16-5p可能在多方面参与糖尿病肾损伤。体外和小鼠动物实验研究表明，miR-16-5p作为血管调控因子，其低表达通过上调VEGF-A、VEGFR2、FGF-R1基因表达，参与调控血管内皮细胞的增殖、迁移，导致微循环功能障碍和影响血管生成等[13]。负向调控过高表达的VEGF-A可使小鼠DKD模型肾功能得到改善[14]。但miR-16-5p具体如何参与DKD病情进展的研究目前尚未见相应报道。还有研究[12]认为DKD的发生发展与肾脏慢性炎症有关。慢性炎症将最终导致肾纤维化、肾功能衰竭。miR-16-5p可能是一种与炎症负向相关的调控因子，其表达下调与炎症有关。在大鼠糖尿病模型中，miR-16-5p的水平与肾脏病理指标呈负相关，正向调控miR-16-5p的表达对糖尿病诱导的肾纤维化有保护作用[15]。国内外研究[16]报道，miR-16-5p在LPS诱导的急性肺损伤的模型中表达下调，通过上调miR-16-5p能抑制炎症反应、减轻肺损伤。同样，在系统性红斑狼疮患者体内miR-16-5p也存在表达下调，并且其与狼疮病情活动有关[17]。对妊娠糖尿病患者的研究中发现，脐静脉内皮细胞下调的miR-16-5p能通过调控COX-2基因转录后表达，介导炎症失调导致内皮功能障碍[18]。这提示miR-16-5p可能是DKD重要的调控靶点。

总之，DKD患者血清miR-16-5p水平明显下调，可作为诊断DKD的指标，具有较高的灵敏度和特异度。且下调的miR-16-5p与DKD患者血糖控制和尿白蛋白水平密切相关，可能参与调控糖尿病肾脏病理损伤。然而，miR-16-5p通过何种机制参与调控有待于进一步研究。

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湖南省自然科学基金面上项目(2017JJ2199)。

周俊(E-mail： 420069344@qq.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.31.016

R587.2

B

1002-266X(2017)31-0055-04

2017-03-13)