转化生长因子-β对人卵巢癌细胞系SK-OV-3活性氧簇表达的影响及其机制

李瑞，宁杨，田训，李莉，王玉兰，曾珍，龚丹妮，黄磊，李贺梅，张庆华

(华中科技大学附属武汉中心医院，武汉 430014)

·基础研究·

转化生长因子-β对人卵巢癌细胞系SK-OV-3活性氧簇表达的影响及其机制

李瑞，宁杨，田训，李莉，王玉兰，曾珍，龚丹妮，黄磊，李贺梅，张庆华

(华中科技大学附属武汉中心医院，武汉 430014)

目的 观察转化生长因子-β(TGF-β)对人卵巢癌细胞系SK-OV-3活性氧簇(ROS)表达的影响，并探讨其可能机制。方法 取对数生长期SK-OV-3细胞，随机分为两组，观察组用2 mL培养液+2 μL无血清DMEM配制的5 μg/mL TGF-β培养(最终浓度为5 ng/mL)，对照组直接加2 mL培养液。流式细胞仪检测细胞内总的活性氧簇(ROS)产生及线粒体来源的ROS,实时荧光定量PCR检测细胞上皮细胞-间充质转化(EMT)变化各指标、线粒体呼吸链复合体Ⅲ组分mRNA。结果 观察组及对照组总ROS产生量分别为3 159±42.92、1 062±24.41，两组比较，P<0.05。观察组及对照组细胞内线粒体来源ROS产生量分别为1 254±29.04、1 039±17.32，两组比较，P<0.05。观察组E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、ZEB1分别是对照组的0.200 0、6.739 8、4.487 9、1.639 5倍，P均<0.05。观察组CYC1、TTC19、UQCRC1、UQCRC2、UQCR10、UQCRB、UQCRFS1、UQCRH、UQCRQ mRNA表达水平较对照组改变倍数分别为0.89、1.04、1.09、0.87、1.17、1.18、0.92、1.09、1.07倍，P均>0.05。观察组CYC1、TTC19、UQCRC1、UQCRC2、UQCRFS1蛋白水平较对照组改变倍数分别为1.01、0.97、1.07、0.99、1.03倍，P均>0.05。结论 TGF-β诱导细胞内总的ROS表达增加，但过量ROS并非来源于线粒体，机制可能是通过调控细胞内氧化-抗氧化平衡系统的关键酶从而改变细胞内的ROS水平。

转化生长因子-β；人卵巢癌细胞系；SK-OV-3细胞；活性氧簇；上皮细胞-间充质转化；线粒体呼吸链复合体Ⅲ

转化生长因子-β(TGF-β)是肿瘤发生及转移的关键调控者，其在卵巢癌复发灶的表达水平比卵巢癌原发灶高[1,2]，并且通过诱导卵巢癌细胞发生上皮细胞-间充质转化(EMT)从而增强卵巢癌细胞的侵袭与转移能力[3,4]。TGF-β信号通路改变引起的EMT等变化是肿瘤增殖、侵袭及转移的重要原因[5,6]。近期有关乳腺癌及肾癌的研究显示，TGF-β诱导细胞内ROS产生增多，并与癌细胞发生EMT密切相关[7,8]。但是，TGF-β诱导细胞内ROS产生的机制尚不明确。本研究观察了TGF-β对人卵巢癌细胞系SK-OV-3活性氧簇(ROS)表达的影响，并探讨其可能机制。

1 材料与方法

1.1 材料 人卵巢癌细胞系SK-OV-3购自美国模式培养物集存库(ATCC)。MyCoy′5A培养基、胰酶、胎牛血清及TRIzol试剂购自Thermo Fisher公司，逆转录试剂购自Takara公司，CYC1、TTC19、UQCRC1、UQCRC2、UQCRFS1抗体购自Proteintech公司，TGF-β来源于R&D公司，CM-H2DCFDA、Mito-SOX染料购自Molecular Probes公司，2×实时荧光定量PCR mix购自Genecopoeia公司。实时荧光定量PCR仪购自BioRad公司，流式细胞分析仪购自Beckman公司。

1.2 细胞培养及处理 SK-OV-3细胞用含有10%胎牛血清的MyCoy′5A培养基培养，置于37 ℃、含5%CO2湿度培养箱中常规培养。将处于对数生长期的细胞用胰酶消化，计数后以3×105/孔的细胞密度均匀接种于6孔细胞培养板中，培养24 h后，分成两组，观察组用2 mL培养液+2 μL无血清DMEM配制的5 μg/mL TGF-β培养(最终浓度5 ng/mL)[9]，对照组直接加2 mL培养液，各组均为3个复孔，继续培养24 h后，收集细胞，做后续的RNA提取，每组重复试验3次。

1.3 细胞内总ROS、线粒体来源ROS检测方法 按照说明书，将CM-H2DCFDA及Mito-SOX染料加DMSO配制为10 mmol/L的储液浓度，用37 ℃完全培养基稀释1 000倍成为工作液；将培养的细胞弃掉原有的培养基，分别加入完全培养基稀释完成的CM-H2DCFDA及Mito-SOX染料，避光，37 ℃培养箱中孵育20～30 min，弃去染料，用温的PBS清洗1次，消化，用完全培养基终止，收集细胞，1 200 r/min离心，上流式细胞仪检测荧光，CM-H2DCFDA用流式仪的FL1通道检测，Mito-SOX用流式仪的FL2通道检测，Flowjo 7.6软件分析流式细胞仪所得的结果，结果以10 000个细胞荧光几何平均值表示。

1.4 细胞EMT变化指标、线粒体复合体Ⅲ主要成分mRNA检测方法 采用实时荧光定量PCR法。将6孔板中不同观察组的细胞用PBS洗1次，加入1 mL TRIzol试剂裂解细胞，提取细胞内总RNA，测RNA浓度后，以oligodT逆转录引物，逆转录1 μg RNA为cDNA(反应条件为42 ℃、1 h，72 ℃、10 min)。以cDNA为模板，按2×SYBR实时荧光定量PCR mix的要求，在实时荧光定量PCR仪上扩增及检测(反应条件为95 ℃、10 min，95 ℃、15 s，60 ℃、15 s，72 ℃、30 s处检测信号，循环40次；再65～95 ℃，每升高1 ℃收集1次荧光信号，做溶解曲线)。以GAPDH做为内参，2-ΔΔCT表示目的基因mRNA相对表达水平，ΔΔCT=(CT目的基因-CT管家基因)实验组-(CT目的基因-CT管家基因)对照组。引物由武汉天一辉远公司合成，序列见表1。

表1 各基因实时荧光定量PCR引物序列

1.5 细胞内线粒体复合体Ⅲ主要成分蛋白检测方法 采用Western blotting法。收集不同处理条件的细胞，PBS清洗后，用RIPA裂解液裂解细胞蛋白，冰上裂解20 min，12 000 r/min离心15 min，取上清，BAC法测蛋白，加5×loading buffer，90～100 ℃煮沸10 min后，SDS-PAGE检测CYC1、TTC19、UQCRC1、UQCRC2、UQCRFS1蛋白。

2 结果

2.1 SK-OV-3细胞内总ROS产生量比较 观察组及对照组总ROS产生量分别为3 159±42.92、1 062±24.41，两组比较，P<0.05。

2.2 SK-OV-3细胞内线粒体来源ROS产生量比较 观察组及对照组细胞内线粒体来源ROS产生量分别为1 254±29.04、1 039±17.32，两组比较，P<0.05。

2.3 SK-OV-3细胞EMT变化指标比较 经过5 ng/mL TGF-β作用24 h后，SK-OV-3细胞发生明显EMT变化，E-cadherin mRNA表达降低为对照组的0.20倍，N-cadherin、Vimentin、ZEB1分别是对照组的6.7398、4.4879、1.6395倍，P均<0.05。

2.4 SK-OV-3细胞内线粒体复合体Ⅲ主要成分mRNA比较 观察组CYC1、TTC19、UQCRC1、UQCRC2、UQCR10、UQCRB、UQCRFS1、UQCRH、UQCRQ mRNA表达水平较对照组改变倍数分别为0.89、1.04、1.09、0.87、1.17、1.18、0.92、1.09、1.07倍，P均>0.05。

2.5 SK-OV-3细胞内线粒体复合体Ⅲ主要成分蛋白比较 观察组CYC1、TTC19、UQCRC1、UQCRC2、UQCRFS1蛋白水平较对照组改变倍数分别为1.01、0.97、1.07、0.99、1.03倍,P均>0.05。

3 讨论

卵巢癌是影响女性健康的恶性肿瘤，其发病率位于女性恶性肿瘤的第3位，但病死率却排名第一。而卵巢癌在发现时多数伴随转移，研究卵巢癌转移过程中的变化对卵巢癌的诊治有重要意义。TGF-β是EMT的诱导者，也是肿瘤发生转移的调控因子，多种肿瘤都可以观察到TGF-β水平上调。由于TGF-β通过诱导肿瘤发生EMT变化，进而促进肿瘤侵袭及转移，因此TGF-β水平上调被认为是肿瘤进展的重要标志[12,13]。研究TGF-β在卵巢癌细胞发生EMT过程中细胞发生的改变，将提供卵巢癌诊治方面的新视角。

近期研究表明，TGF-β诱导的ROS信号通路改变与TGF-β引起的EMT相关[7,14]，但TGF-β诱导细胞内ROS升高的机制尚不清楚。因此，深入研究TGF-β如何诱导细胞内ROS升高能更进一步明确肿瘤进展及转移的机制。前期研究报道，细胞内ROS受多种因素调控，即NADPH氧化酶(Nox家族)、线粒体、过氧化物酶体、内质网、环氧合酶、细胞色素P450、黄嘌呤氧化酶、一氧化氮合酶等，其中线粒体及Nox家族是细胞内ROS产生的主要来源[15]。前期研究显示，过量ROS产生是TGF-β促进肿瘤发生EMT的原因之一，所以抑制TGF-β诱导产生ROS将是肿瘤治疗的一个方面。因此，探索TGF-β诱导细胞ROS产生机制是目前的研究热点之一。

本研究发现，TGF-β可以诱导SK-OV-3发生EMT变化，进而检测细胞内总的ROS，发现细胞内总的ROS量明显升高。虽然多数研究认为线粒体尤其是线粒体复合体Ⅲ是细胞内ROS产生的主要来源，但我们研究发现TGF-β并未改变细胞内线粒体来源的ROS产生量。进而我们检测SK-OV-3细胞在TGF-β作用后线粒体复合体Ⅲ主要组分mRNA及蛋白表达水平的变化，结果显示线粒体复合体Ⅲ主要组分CYC1、TTC19、UQCRC1、UQCRC2、UQCR10、UQCRB、UQCRFS1、UQCRH、UQCRQ mRNA及CYC1、TTC19、UQCRC1、UQCRC2、UQCRFS1蛋白表达并无明显变化。因此，本研究证明TGF-β升高细胞内总的ROS并不来源于线粒体，TGF-β可能通过调控细胞内氧化-抗氧化平衡系统的关键酶从而改变细胞内的ROS，确切的生物学机制仍需进一步研究。

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武汉市卫生局临床医学科研项目(WX11B05)。

张庆华(E-mail： zhangqh66@qq.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.31.008

R737.31

A

1002-266X(2017)31-0029-03

2016-10-12)