MSP58沉默对肺癌细胞A549细胞生物学行为的影响*

张树天，崔 凯，徐春盛，钟代星△

1．第四军医大学学员一旅四营十四连(西安710032)，2．第四军医大学唐都医院胸腔外科(西安710038)3．解放军第537医院(宝鸡721006)

MSP58沉默对肺癌细胞A549细胞生物学行为的影响*

张树天1，崔 凯2，徐春盛3，钟代星2△

1．第四军医大学学员一旅四营十四连(西安710032)，2．第四军医大学唐都医院胸腔外科(西安710038)3．解放军第537医院(宝鸡721006)

目的：探讨沉默MSP58基因对肺癌细胞A549增值，细胞周期和侵袭能力的影响。方法：化学合成针对MSP58基因的siRNA，转染肺癌细胞A549，RT-PCR和Western-blot检测MSP58基因的mRNA和蛋白水平，利用MTT法绘制细胞生长曲线，流式细胞仪分析细胞周期，Transwell小室实验观察侵袭能力。结果：针对MSP58基因的siRNA转染A549细胞48h后，与阴性对照组和空白对照组相比，siRNA组显著降低MSP58的基因表达和蛋白表达，细胞的增值受到抑制，并随着时间延长抑制明显，细胞发生G1期阻滞，细胞的侵袭力下降。结论：利用特异性siRNA沉默MSP58基因的表达，可以显著抑制肺癌A549细胞增值和侵袭能力，MSP58有可能成为肺癌治疗的新靶点。

肺癌在中国是发病率最高的肿瘤之一[1]。尽管肺癌的靶向治疗及其他治疗取得了一定的进展，但肺癌的预后仍然很差，5年生存率只有16%左右[2]。MSP58(58-kDa microspherule protein)在细胞核及核仁中具有转录调节功能，与多种细胞周期相关的转录因子可发生相互作用，比如：转录因子Daxx，STRA13，Nrf1和RNA结合蛋白FMR[3-6]。前期试验证实，MSP58在结直肠癌、肝癌、胶质瘤和胃癌中的表达明显增加，并且与患者的预后有明显的相关。本研究针对MSP58合成特异性siRNA，沉默该基因在肺癌细胞系A549中的表达，探讨MSP58基因对肺癌细胞A549恶性表型的影响并探讨其相关机制。

材料与方法

1 细胞及试剂 细胞系A549从中科院上海细胞研究所购买； RPMI-1640细胞培养；胎牛血清(杭州四季青生物工程公司)；Total RNA 提取剂Trizol，逆转录试剂盒 ( TaKaRa 公司)；Transwell 小室( Corning 公司)；MSP58一抗(Abnova，抗鼠，1∶500)β-actin(武汉博士德公司抗兔 1∶1000)；lipofectamine 2000(Invitrogen公司)；MTT(北京鼎国生物公司)。

2 化学合成siRNA片段 siRNA-MSP58序列：正义链:5`- CAGCUCAUCAUCGAACUUCdTdT-3`，反义链: 5`-GAAGUUCGAUGAUGAGCUGdTdT-3`。 siRNA-negative control 序列：正义链：5`-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3`，反义链：5`-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3`。siRNA 序列由上海吉玛制药技术有限公司合成。

3 细胞培养、转染及分组 细胞系A549用RPMI-1640(含10%胎牛血清)常规培养。细胞于转染前换液并铺板，转染方法按Lipofectamine 2000说明书完成。细胞转染6 h后，换含10%胎牛血清的培养液继续培养48 h。细胞分组：实验组为转染针对MSP58基因的特异性siRNA，阴性对照组转染siRNA-阴性对照组，空白对照组为正常培养的A549细胞。

4 利用RT-PCR反应检测各组细胞中MSP58 mRNA的表达量 转染48 h后根据Trizol试剂盒说明书提取各组细胞的总RNA。RT-PCR反应根据Takara反转录PCR试剂盒说明书完成，上游引物： 5' -ACGCCCTGCTCTACGAT -3'，下游引物：5' -TCATGCCTGTGATGCTGTC -3'，产物长度483bp。扩增条件为：95℃预变性 5 min ；94℃ 30 s，退火 58℃30 s，延伸 72℃ 1 min，30 个循环；最后延伸 72℃7 min。反应结束后吸取10 μl产物行1%琼脂糖凝胶电泳，并观察目的片段。

5 利用Western-blot实验检测各组细胞中MSP58蛋白的表达量 转染48 h后采集细胞并进行裂解，提取蛋白，按比例加入上样缓冲液煮沸7 min，每孔加样20 μl，常规电泳、转膜，5%脱脂牛奶室温封闭1 h，加入1∶500MSP58抗体或1∶1000的β-actin抗体，置入4°C冰箱过夜。1∶4000的羊抗小鼠或羊抗兔二抗室温下孵育1 h，利用化学法发光，胶片显色后进行结果分析。

6 利用MTT实验检测细胞增殖能力 取对数生长期细胞接种于96孔板中(2×103个细胞/孔)，每组细胞设置5个复孔，另设置调零对照组(不加细胞，只加培养基)，细胞贴壁后进行转染，6 h后换成完全培养基。分别于转染后24 h，48 h，72 h，96 h，120 h，144 h加入20 μl的MTT( 5 mg /ml) /孔，37℃温箱孵育4 h后弃去上清，各孔加入150 μL二甲基亚砜，持续振荡10 min，直至紫色结晶完全溶解，利用酶标仪490 nm波长检测各孔的光密度值，重复3次，根据检测结果绘制细胞增殖曲线。

7 利用流式细胞仪检测细胞周期分布情况 转染48 h后的收集细胞，用 0.9 ml PBS制成单细胞悬液，缓慢加入纯乙醇2.1 ml固定细胞，置入4℃冰箱过夜。离心后弃去乙醇，PBS洗涤细胞2次。100 μl PBS充分悬浮细胞，后加入300 μl碘化丙啶染色液，充分反应15 min。利用流式细胞仪检测细胞周期分布情况并详细记录。

8 利用Transwell实验检测细胞侵袭能力 转染24 h后，收集细胞，用无血清培养基充分重悬细胞，调整其密度至1×105个/ml，在Transwell 小室的上室接种200 μL细胞悬液，下室放置500 μl RPMI-1460完全培养基(含10%胎牛血清)，培养24 h。4%多聚甲醛固定，结晶紫染色15 min。随机选取膜上5个高倍镜下视野，读取穿膜细胞数，计算平均值。

结 果

1 siRNA对A549细胞中MSP58的mRNA和蛋白表达量影响 根据RT-PCR和Western-blot实验检测结果显示，siRNA-MSP58转染组的MSP58 基因mRNA和蛋白表达量均显著低于阴性对照组和空白对照组(P<0.05)；而阴性对照组和空白对照组的MSP58基因mRNA与蛋白表达水平比较差异无统计学意义(P>0.05),见图1。

A：siRNA转染后实验组MSP58mRNA含显著低于对照组(*P<0.01)；B：实验组MSP58的蛋白表达量显著低于对照组(*P<0.01)

图1 siRNA对A549细胞中MSP58mRNA和蛋白表达影响

2 细胞增殖曲线结果 与阴性对照组和空白对照组相比，随着培养时间的增加，siRNA-MSP58组A549细胞数量明显少于阴性对照组和空白对照组(P<0.01)，而两对照组间比较差异无统计学意义(P>0.05),见图2。

实验组增殖能力显著小于空白对照组，*P<0.01；实验组增殖能力显著小于阴性对照组，P<0.01

图2 siRNA- MSP58对A549细胞增殖的影响

3 siRNA-MSP58对肺癌细胞系A549细胞周期分布情况的影响 流式细胞检测的结果显示，转染组G0/G1期细胞比例显著低于阴性对照组和空白对照组(P<0.01)，而两对照组间比较差异无统计学意义(P>0.05)，见图3。

4 siRNA- MSP58对A549细胞侵袭力的影响 Transwell侵袭实验结果显示，A549细胞转染MSP58 siRNA 48 h后，siRNA-MSP58转染组穿过小室的细胞数量明显少于阴性对照组和空白对照组(P<0.05)，而两对照组间比较差异无统计学意义(P>0.05)，见图4。

转染siRNA-MSP58后，A549细胞发生G1期阻滞，S期细胞数量显著小于空白对照组和阴性对照组(***P<0.01)

转染siRNA-MSP58后，A549细胞侵袭能力显著弱于空白对照组和阴性对照组(***P<0.01)

讨 论

目前研究认为，MSP58是一个癌基因。MSP58可以特异的被癌基因v-jun诱导表达，使纤维母细胞恶变，细胞的增殖能力大幅度加强，并出现非锚定依赖生长的表型[7]。抑癌基因PTEN 通过c-端区域可以抑制MSP58诱导纤维母细胞恶变[8]。同时，MSP58在结直肠癌、肝癌、胶质瘤和胃癌中的表达明显增加，与肿瘤的淋巴转移密切相关，MSP58表达量越高，患者的预后越差。本研究证实MSP58基因在肺癌细胞系A549中高表达，提示MSP58基因可能与A549的恶性表型相关，在肺癌中可能是一种癌基因。

RNA干涉(siRNA)作为一个有效的工具，被广泛应用与基因功能的研究，并有潜在的临床应用价值，包括肿瘤的治疗[9]。本研究化学合成的siRNA-MSP58，可以特异性的抑制A549细胞中MSP58的表达，为进一步研究MSP58的功能提供了研究基础。实验证实，转染MSP58 siRNA后，A549细胞的体外增殖能力明显下降。研究还发现，MSP58 siRNA能够有效的降低A549细胞的侵袭能力。这与前期的实验结果一致。MSP58沉默后，可明显抑制胶质瘤细胞增殖和侵袭[10]，并降低了胶质瘤细胞在裸鼠体内成瘤能力。在食管癌细胞中，MSP58 siRNA通过调节P21，CDK4 和cyclin D1分子的表达，抑制食管癌细胞在体内和体外的增殖。

多数抑制细胞增殖的因子是通过调节细胞周期而实现的。MSP58的表达依赖于细胞周期，组织分部实验证实，在外周血的白细胞、胸腺以及睾丸等增殖旺盛的细胞和组织中MSP58的表达含量显著升高。并且，MSP58与周期相关分子P120，STRA13以及P78可发生相互作用，调节细胞周期的改变，进而影响细胞的增殖。本实验中，流式细胞术结果显示：沉默MSP58基因的表达后，细胞周期发生了G0/G1阻滞，部分解释了MSP58 siRNA抑制A549细胞增殖的原因，其分子机制及体内的功能需进一步实验研究。

综上所述，在肺癌细胞A549的增殖和侵袭转移过程中，MSP58基因可能发挥着重要作用，利用RNA干扰技术能够特异性地阻断MSP58的表达，可有效抑制肺癌细胞的增殖和侵袭。

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(收稿：2017-06-10)

RNAi-mediated silencing of MSP58 suppressesproliferation and migration in lung cancer cells A549

Zhang Shutian, Cui Kai， Xu Chunsheng，et al.

14 Company 4 Battalion 1 Brigade, the Fourth Military Medical University(Xi’an 710032)

Objective：To determine the effect of MSP58 knockdown by RNA interference (RNAi) on the proliferation and migration in lung cancer cells A549. Methods：The siRNA targeting MSP58 gene and negative control siRNA were synthesized and transfected to lung cancer cells A549. RT-PCR and Western-blot were applied to observe the expression of mRNA and protein level of MSP58. The cell growth curve was drawn by MTT. Cell cycle was analyzed by flow cytometry. The cell migration ability was detected by Transwell assay. Results: After transfected 48h, comparing to the negative group and blank group, the expression of MSP58 mRNA and protein was down-regulated by siRNA targeting MSP58 gene. The cell proliferation of A549 in siRNA group was suppressed in a time-dependent manner, cell cycle was blocked in G1 phrase, and the ability of migration declined significantly. Conclusion: Specific siRNA targeting MSP58 efficiently inhibits the proliferation and migration in A549 cells，and the MSP58 gene is a promising anti-tumor target of lung cancer.

Lung Neoplasms @MSP58 Cell Biology

*国家自然科学基金资助项目(81402545)

肺肿瘤 @MSP58 细胞生物学

R734.2

A

10.3969/j.issn.1000-7377.2017.08.003

△通讯作者