BAG3蛋白ser187位点磷酸化与胶质瘤发生发展的相关性研究*

韩福新,胡世颉，闫志强，胡学安，李 亮，赵东升，董必锋，费 舟，李 兵

第四军医大学西京医院神经外科(西安710032)

·基础研究·

BAG3蛋白ser187位点磷酸化与胶质瘤发生发展的相关性研究*

韩福新,胡世颉，闫志强，胡学安，李 亮，赵东升，董必锋，费 舟△，李 兵

第四军医大学西京医院神经外科(西安710032)

目的：观察BAG3蛋白在胶质瘤中的表达，及其ser187位点磷酸化与胶质瘤间的相关性。方法：收集胶质瘤组织标本，进行分子生物学实验，观察BAG3蛋白在胶质瘤组织中的表达情况及BAG3蛋白ser187位点磷酸化对细胞侵袭的影响。结果：①IHC：BAG3在IV级胶质瘤组织表达显著高于正常脑组织及Ⅰ、Ⅱ级胶质瘤组织(P<0.05)。②Western Blot：BAG3蛋白在II、III、IV级别胶质瘤表达量，显著高于正常脑组织(P<0.05)，且相对于II级胶质瘤，在III、IV级胶质瘤中表达显著增高(P<0.05)，而在III级、IV级胶质瘤组织中表达量之间无显著性差异(P>0.05)。③三维Matrigel transwell转移小室实验，S187A-BAG3蛋白过表达U87细胞侵袭Matrigel模拟基质膜的细胞数显著高于U87细胞和S187D-BAG3过表达U87细胞。结论：BAG3蛋白胶质瘤组织中表达量高，且在IV级胶质瘤组织中，BAG3蛋白的表达明显高于I、II级及正常脑组织，且S187位点磷酸化能抑制U87细胞的侵袭。

本研究收集了胶质瘤组织98例，采用免疫组织化学、蛋白印迹、质粒转染技术及三维Matrigel transwell转移小室实验观察BAG3蛋白在胶质瘤组织中的表达情况及BAG3蛋白ser187位点磷酸化对细胞侵袭的影响，现报告如下。

资料与方法

1 一般资料 收集2014年12月至2016年12月胶质瘤组织标本94例，按WHO2000年分级分类标准，其中I级胶质瘤16例，II级29例，III级328例；IV级25例。取脑外伤或良性病变手术病人未受损正常脑组织56例为正常对照。分别以4 μm厚度连续切片用以免疫组织化学实验，及5 mm×5 mm×5 mm大小于-80 ℃冰箱或液氮罐中保存，以备蛋白印迹实验使用。购置U87细胞系(赛齐上海生物工程有限公司)传代，用以质粒转染，及细胞侵袭实验。

2 实验方法

2.1 免疫组织化学：Anti-Bag3兔抗人多克隆抗体购自Santa Cruz公司，工作浓度为1∶100。DAB显色试剂盒购自碧云天生物技术有限公司。

2.2 蛋白印迹Western Blot: Anti-Bag3兔抗人抗体1∶100，Anti-GAPDH鼠抗人抗体1∶400；二抗：按照1∶2500比例用TBST稀释辣根过氧化物酶(HRP)标记鼠抗兔IgG。

2.3 蛋白条带分析：将显影获得的结果，在Quantity One 软件(Bio-Rad)下进行分析，将各观察蛋白条带的光密度值除以对照组蛋白的光密度值，获得其相对值。再将观察蛋白的相对值除以GAPDH相对值，即观察蛋白的相对表达量。

2.4 建立BAG3及BAG3各突变型稳定过表达U87细胞系，及BAG3过表达U87细胞(WT-BAG3)、阻碍磷酸化BAG3过表达U87细胞(S187A-BAG3)、拟磷酸化BAG3过表达U87细胞(S187D-BAG3)真核表达载体。按照说明书进行细胞转染，转染试剂盒为Invitrogen公司的Lipofectamine 2000TM Reagent。分析s187位点磷酸化的BAG3蛋白对细胞侵袭的影响。

3 结果判定 BAG3表达(-)：为细胞核蓝染，胞浆不染色。BAG3表达(+)：细胞核蓝染，胞浆染成棕红色。计数5个高倍镜(×400)的BAG3蛋白表达阳性细胞数，及胶质瘤细胞总数。BAG3蛋白表达情况：(-)(<5%阳性细胞)，(+)(5%<阳性细胞<40%)，()(>40%阳性细胞)。

结 果

1 IHC实验结果 在正常脑组织中BAG3蛋白阳性率为9.4%，在Ⅰ、Ⅱ级胶质瘤组织中为39.2%，在 IV级胶质瘤组织中为81.6%，BAG3在IV级胶质瘤组织表达显著高于正常脑组织及Ⅰ、Ⅱ级胶质瘤组织(P<0.05)。

2 Western blot结果 BAG3蛋白在II、III、IV级别胶质瘤表达量显著高于正常脑组织(P<0.05)，且相对于II级胶质瘤，在III、IV级胶质瘤中表达显著增高(P<0.05)，而在III级、IV级胶质瘤组织中表达量之间无显著性差异(P>0.05)。

3 BAG3蛋白Serl87磷酸化抑制了肿瘤细胞的增殖 三维Matrigel transwell转移小室实验结果，S1 87A．BAG3稳定过表达U87细胞的侵袭能力显著提高，通过DAPI染料对细胞核染色后，荧光显微镜观察结果示大量细胞穿过小室膜，对三维Matrigel transwell转移小室实验结果进行定量分析，结果提示S187A．BAG3蛋白过表达U87细胞侵袭通过Matrigel模拟基质膜的细胞数显著高于U87细胞和S187D-BAG3过表达U87细胞。

讨 论

有研究显示，BAG3蛋白通过结合热休克蛋白(HSP70)，从抑制泛素化蛋白酶的降解途径，进而损害NF-αB信号通路，促进TNF介导的细胞凋亡发生[1]。在胶质瘤细胞中，BAG3蛋白能促进了HSP70与BAX的结合[2-3]，阻止BAX向线粒体的运送，促进胶质瘤细胞的存活。越来越多研究结果显示，上皮细胞间质转化(EMT)在恶性肿瘤的发展过程中起了重要的作用[4]。BAG3磷酸化的具体激酶及具体作用靶点及其功能尚未完全清楚，有报道指出BAG3蛋白Setl87位点磷酸化修饰参与了EMT过程的调节[5]，促进了细胞EMT表型转换，并提高了甲状腺癌细胞的迁移和侵袭能力。

IHC及Westen Blot结果均显示在I、II、III、IV级人脑胶质瘤组织中，BAG3蛋白表达均有表达，特别是IV级胶质瘤组织中，BAG3蛋白的表达明显高于I、II级及正常脑组织。这说明BAG3蛋白可能参与了胶质瘤的形成。结果提示：S187位点磷酸化与非磷酸化BAG3蛋白有着相反的作用，S187位点磷酸化能抑制U87细胞的侵袭，也说明抑制了BAG3蛋白的表达，能抑制胶质瘤细胞的侵袭。

总之，本文结果表明BAG3蛋白可能参与了胶质瘤的形成，且S187位点磷酸化能抑制U87细胞的侵袭，但今后仍需对S187位点磷酸化抑制U87细胞的机制进行深入研究。

[1] 刘宝琴,宗志红,李 超,等.蛋白酶体抑制剂对肝癌HepG2细胞BAG3表达影响及其机制探讨[J]. 中华肿瘤防治杂志,2014,18:1395-1399.

[2] 朱华渊,伏 媛,吴 微,等. BAG3在急性髓系白血病中的表达及临床价值[J]. 中国实验血液学杂志,2015,4:925-929.

[3] 李继强,杨吉安,邵灵敏,等. 稳定低表达BAG3的胶质母细胞瘤U87细胞株的构建及鉴定[J]. 中国临床神经外科杂志,2015,6:353-356.

[4] 陈浩月,刘 澎,孙 淼,等. Bag3基因在慢性淋巴细胞白血病的表达及其与预后关系的研究[J]. 中国实验血液学杂志,2010,4:838-842.

[5] 崔 凯,王武平,孙 盈,等.非小细胞肺癌中Twist通过TGF-β/Smad3信号通路促进EMT的发生[J].陕西医学杂志,2016,45(11):1462-1465.

(收稿：2017-03-22)

The association between Ser187 BAG3 protein phosphorylationand occurrence and development of glioma

Han Fuxin，Hu Shijie，Yan Zhiqiang，et al.

Department of Neurosurgery，Xijing Hospital，Fourth Military Medical University(Xi’an 710032)

Objective: to observe the BAG3 protein expression in glioma，and its ser187 phosphorylation associated with glioma. Methods:Collected 94 glioma tissue and 56 normal brain tissue，use molecular biological technique，observe the expression of BAG3 protein in the gliomas tissue and effects of the BAG3 protein ser187 phosphorylation on cell invasion. Results:① The expression level of BAG3 in IV glioma group is significantly higher than normal brain tissue and Ⅰ,Ⅱ grade glioma tissues(P<0.05). ②Western Blot results: the expression level of BAG3 protein in II，III，IV glioma ,which was significantly higher than that of normal brain tissue (P<0.05),the level of expression in and grade III or IV glioma ,which was significantly higher than that of grade II (P<0.05)，expressed in level III and IV grade has no significant differences (P>0.05). ③The 3-d Matrigel transwell transfer chamber experiment results，the results hint S187A - BAG3 protein overexpression of U87 cell invasion on Matrigel simulation matrix membrane of cells was significantly higher than that of U87 cells and S187D - BAG3 express U87 cells.Conclusion:The level of BAG3 protein expression in IV glioma tissues，which is significantly higher than I，II and normal brain tissue，and S187 phosphorylation sites can inhibit U87 cells invasion.

Glioma @BAG3 protein @Ser187 phosphorylation sites

*陕西省社会发展科技攻关项目(2015SF030)

神经胶质瘤 @BAG3蛋白 @ser187位点磷酸化

R739.41

A

10.3969/j.issn.1000-7377.2017.08.001

△通讯作者