靶向Dicer的RNA干扰对卵巢癌细胞生物学功能的影响▲

何中慧 卢芳芳 徐 红 王泽华 迟 博 况 燕*

(1 广西医科大学第一附属医院妇科，南宁市 530021；2 广西医科大学，南宁市530021；3 华中科技大学同济医学院附属内科医院妇产科；武汉市 430074)

靶向Dicer的RNA干扰对卵巢癌细胞生物学功能的影响▲

何中慧1卢芳芳2徐 红1王泽华3迟 博1况 燕1*

(1 广西医科大学第一附属医院妇科，南宁市 530021；2 广西医科大学，南宁市530021；3 华中科技大学同济医学院附属内科医院妇产科；武汉市 430074)

目的 探讨Dicer抑制对卵巢癌细胞A2780增殖和迁移能力的影响，以进一步明确Dicer在卵巢癌生物学行为中的作用。方法 合成Dicer的小干扰RNA(Dicer siRNA)转染A2780细胞并筛选有效siRNA，实时定量PCR(RT-PCR)检测Dicer的mRNA的表达，蛋白印迹法检测Dicer蛋白的表达，MTT检测细胞生长活力，Transwell小室检测细胞迁移能力，流式细胞仪测定细胞周期。结果 与未转染组相比，siRNA1658转染组Dicer基因mRNA的表达最低，为(0.194±0.002)，明显低于siRNA1897转染组的(0.535±0.015)，差异有统计学意义(P<0.001)，但与siRNA334组的(0.251±0.014)相比，差异无统计学意义(P>0.05)。实时定量PCR结果显示，以未转染A2780细胞Dicer mRNA表达水平为100%，siDicer-A2780细胞Dicer的mRNA水平相对下降(0.157±0.012)，差异有统计学意义(P<0.001)。以未转染A2780细胞Dicer的蛋白表达水平为100%，siDicer-A2780细胞Dicer的蛋白水平相对下降(0.153±0.021)，差异有统计学意义(P<0.001)。在种板后第3天、第4天、第5天，与对照组细胞比较，siDicer转染的A2780细胞增殖能力增强(P均<0.05)。与对照组转染siNC的细胞相比，转染siDicer 96 h后，siDicer-A2780细胞的增殖活性平均上升了23%。细胞周期分析结果显示siDicer-A2780细胞中G0/G1期占(44.26±0.48)%，S期占(25.05±1.20)%，G2/M期占(21.53±0.77)%；对照组siNC-A2780细胞中G0/G1期占(52.79±1.11)%，S期占(20.01±1.22)%，G2/M期占(19.80±0.24)%。siDicer-A2780细胞S期和G2/M细胞较对照组明显增加(P均<0.05)，而G0/G1期细胞则减少(P<0.001)。与对照组siNC-A2780细胞的穿膜细胞数相比，抑制Dicer表达的siDicer-A2780 细胞的穿膜细胞数增加(3.99±0.29)倍(P<0.001)。结论 Dicer基因具有抑制卵巢癌细胞增殖和侵袭的能力。

卵巢癌；Dicer基因；细胞增殖；细胞侵袭；治疗靶点

Dicer属于核糖核酸酶III(RNaseIII)的家族成员，是微小分子RNA(miRNA)生物合成过程中的关键酶。作为miRNA的上游调控因子，Dicer下调可能通过降低miRNA的表达来促进细胞转化和肿瘤的形成[1]。但目前关于Dicer对卵巢癌细胞生物学功能影响的报道甚少。为进一步明确Dicer与卵巢肿瘤生长和转移的关系，通过靶向干扰Dicer的小干扰RNA(siRNA)沉默Dicer基因，抑制Dicer基因在卵巢癌细胞A2780中的表达，探讨Dicer抑制对卵巢癌细胞生物学功能的影响。现将结果报告如下。

1 材料与方法

1.1 试剂和材料 人卵巢癌细胞A2780购自武汉大学中国典型培养物保藏中心(CCTCC),RPMl640培养液及胎牛血清购自美国Gibco公司，逆转录酶试剂盒和荧光染料SYBR Green Real time PCR反应液购自日本Toyobo公司，Trizol购自美国Invitrogen公司，兔抗人H3多克隆抗体购自美国Bioworld Technology，鼠抗人Dicer多克隆抗体购自美国abcam公司，辣根过氧化物酶(Horseradish peroxidase HRP)标记二抗购自美国Santa Cmz公司，Bradford蛋白定量试剂盒和增强化学发光ECL显色试剂盒购自上海碧云天生物技术研究所，PCR引物由上海英骏生物技术有限公司合成。

1.2 小干扰RNA(siRNA) 小干扰RNA(siRNA)质粒载体Dicer-siRNA的设计合成，序列如表1。

表1 siRNA载体Dicer-siRNA的设计合成

1.3 A2780细胞转染 本实验以Dicer-siRNA转染的A2780细胞作为Dicer-siRNA组(A2780-siDicer)，以negative control-siRNA转染的A2780细胞作为非特异性序列转染组(A2780-siNC)，不作处理的作为未转染对照组(A2780)。卵巢癌细胞株A2780培养于含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基中，置于37℃、5%CO2、饱和湿度恒温孵育箱内传代培养。收集细胞，将A2780细胞以5×105个/孔接种于6孔培养板，次日，细胞贴壁生长汇合至50%时，取Dicer-siRNA1658、Dicer-siRNA334、Dicer-siRNA1879、negative control-siRNA各100 pmol和脂质体lipofectamine 2000 5 μ混匀并转染细胞，未转染对照组则加入1 640培养液，具体操作按Lipofectamine 2 000说明书要求进行。

1.4 Dicer mRNA的表达 Trizol法提取各组细胞总RNA，按Toyobo逆转录试剂盒说明书将mRNA逆转录为cDNA。Dicer的上游引物为：5′- GTGGTTCGTTTTGATTTGCCC-3′，下游引物为：5′- CGTGTTGATTGTGACTCGTGGA -3′。以β-actin为内参，上游引物5′-GTCCACCGCAAATGCTTCTA-3′，下游引物：5′- TGCTGTCACCTTCACCGTTC-3′。在ABI 7300荧光定量PCR仪上进行检测。反应条件，95℃1 min，95℃15 s，58℃15 s，72℃45 s，40个循环，用2-△△ct法计算Dicer /β-actin比值。实验结束后分析熔解曲线，以鉴定产物的单一性。在PCR过程中设立无模板阴性对照。本实验重复3次。

1.5 Dicer蛋白的表达 提取各组细胞总蛋白，Bradford方法测定蛋白浓度。10%十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离并将蛋白转至硝酸纤维素膜，鼠抗人Dicer多克隆抗体(1 ∶1 000；abcam) 4℃孵育过夜，HRP标记二抗(1 ∶5 000；Santa Cruz)室温孵育1 h后ECL化学发光观察，以β-actin作为等量上样的标准，结果应用条带密度分析软件Quantity One软件分析，计算 Dicer/β-actin比值表示Dicer蛋白的表达水平。本实验重复3次。

1.6 细胞生长活力 取各组对数生长期细胞，调整细胞密度按2×103/孔接种96孔板，共接种5板。每日取1块板，每孔加入20 μL 5 mg/mL MTT，37℃继续培养4 h，加入DMSO 150μL，用酶标仪以570 nm波长测量各孔吸光度(A570)值，计算光密度(OD)值，连续5 d，绘制细胞的生长曲线。

1.7 细胞体外迁移能力的测定 采用直径6.5 mm、孔径8 μm的Transwell小室进行细胞迁移能力的检测，结晶紫染色，显微镜下计数穿膜细胞数，每个样本随机计数5个视野，取平均值。每组设3个复孔，实验重复3次。

1.8 流式细胞仪测定细胞周期 采用流式细胞仪测定细胞生长周期，分析DNA含量，应用相关软件分析G0期、S期和G2期的细胞比例。

1.9 统计学方法 采用软件SPSS 13.0进行统计学的分析，计量资料结果用(x±s)表示, 两组数据的比较采用t检验，两组以上数据采用单因素方差分析(One-Way ANOVA)，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 Dicer siRNA转染A2780细胞并筛选有效siRNA 靶向干扰Dicer的三种siRNA334、siRNA1658、siRNA1897分别转染到A2780细胞中，实时定量PCR技术检测目的基因Dicer mRNA的表达。与未转染组相比，siRNA1658转染组Dicer基因mRNA的表达最低，为(0.194±0.002)，明显低于siRNA1897转染组的(0.535±0.015)，差异有统计学意义(P<0.001)；与siRNA334组的(0.251±0.014)相比，差异无统计学意义(P>0.05)，见图1。因此，本研究选择siRNA1658进行后续实验。

Dicer mRNA相对水平

图1 Dicer-siRNA的筛选(1：小siRNA334；2：siRNA1658；3：siRNA1897)

2.2 转染Dicer siRNA1658后A2780细胞的Dicer的沉默效率 实时定量PCR结果显示，以未转染A2780细胞Dicer基因的mRNA表达水平为100%，siDicer-A2780细胞Dicer基因的mRNA水平为(0.157±0.012)，差异有统计学意义(P<0.001)。siNC-A2780转染组细胞Dicer基因的mRNA表达水平为(1.073±0.061)，差异无统计学意义(P>0.05)。表明siRNA1658-Dicer能有效抑制Dicer的mRNA表达，见图2。同时，蛋白免疫印迹实验的结果在蛋白水平验证了siRNA对Dicer的有效抑制。以未转染A2780细胞Dicer基因的蛋白表达水平为100%，siDicer-A2780细胞Dicer基因的蛋白水平下降为(0.153±0.021)，差异有统计学意义(P<0.05)。而siNC-A2780转染组细胞Dicer基因的蛋白水平是未转染组细胞表达水平的(1.013±0.021)，差异无统计学意义(P>0.05)，见图3。

Dicer mRNA相对表达水平

图2 转染siRNA后各组细胞Dicer mRNA的表达(1：A2780；2：A2780-siNC；3：A2780-siDicer)Dicer蛋白表达水平

图3 转染小干扰RNA(siRNA)后各组细胞Dicer的蛋白表达(1：A2780；2：A2780-siNC；3：A2780-siDicer)

2.3 细胞生长情况 在种板后第3天、第4天、第5天，siDicer转染的A2780细胞增殖能力增强，与对照组细胞比较，差异有统计学意义(P<0.05)，见图4。

图4 Dicer-siRNA转染对A2780细胞生长的影响

2.4 细胞增殖情况 与对照组转染siNC的细胞相比，转染siDicer 96 h后，siDicer-A2780细胞的增殖活性平均上升了23%，见图5。

图5 Dicer-siRNA转染对A2780细胞增殖的影响

(1：A2780-siNC；2：A2780-siDicer)

2.5 细胞生长周期情况 细胞周期分析结果显示siDicer-A2780细胞中G0/G1期细胞占(44.26±0.48)%，S期细胞占(25.05±1.2)%，G2/M期细胞占(21.53±0.77)%；对照组siNC-A2780细胞中G0/G1期占(52.79±1.11)%，S期占(20.01±1.22)%，G2/M期占(19.8±0.24)%。siDicer-A2780细胞S期和G2/M细胞较对照组细胞明显增加，而G0/G1期细胞则减少，差异均有统计学意义(P均<0.05)见图6。提示Dicer可能通过调节细胞周期的进程从而影响卵巢癌细胞的增殖能力。

图6 Dicer-siRNA转染对A2780细胞细胞周期的影响

2.6 Transwell迁移实验的结果 在Transwell小室滤膜上，与对照组siNC-A2780细胞的穿膜细胞数相比，抑制Dicer表达siDicer-A2780 细胞的穿膜细胞数增加(3.99±0.29)倍，差异有统计学意义(P<0.001)，见图7。提示Dicer沉默能增强A2780的迁移能力，Dicer表达的下调有助于促进卵巢癌疾病的进展。

(a)

(b)

3 讨 论

微小RNA(miRNA)是一组保守的非编码小RNA。近年研究表明，miRNA表达失调与多种肿瘤相关[2-6]。对多种肿瘤的研究发现存在miRNA的表达谱及其调控的生物学过程的改变[7-8]，miRNAs在肿瘤形成过程中的作用引起研究者的关注。作为miRNA调控的关键因子，Dicer的异常改变可能会导致miRNA的异常表达，并且和很多癌症相关。本研究结果表明，当靶向抑制Dicer酶的siRNA抑制Dicer的表达后，卵巢癌细胞的生物学行为发生明显变化，增殖与侵袭能力均明显增强。结果提示，作为miRNA的关键调控因子，降低Dicer酶的表达可能导致成熟miRNA表达水平的降低，从而促进肿瘤的形成。近来对其他肿瘤细胞的研究也发现了类似的结果。体外实验发现，抑制Dicer的表达可以明显增强乳腺癌细胞的侵袭性及人源胚胎肾HEK293T细胞的迁移能力[9]。而且，在分子水平，抑制人肿瘤细胞株U251，MCF-7和SCG7901中Dicer的表达可以提高细胞周期相关分子cyclin A和PCNA及侵袭促进因子MMP-2和MMP-9的表达。活体实验表明，皮下注射腺病毒基因沉默Dicer的乳腺癌MCF-7细胞可以促进肿瘤细胞的生长[10]。

此外，通过靶向抑制miRNA成熟过程中包括Dicer酶在内的几个重要的酶，导致癌细胞miRNA水平显著降低，癌细胞随之出现进一步恶化的表型。在实验动物体内，miRNA加工受损的细胞会加速形成肿瘤，且更具侵袭性。这些研究结果均表明Dicer酶起着一个抑癌基因的作用，降低其表达，可能全面抑制miRNAs的表达，可以导致肿瘤生物学特征的恶化，促进肿瘤的形成。

本实验发现，靶向Dicer酶的siRNA抑制A2780细胞Dicer的表达会促进细胞周期的进程。有意思的是，研究表明，降低乳腺癌MCF-7细胞Dicer的表达会导致G1停滞并提高对铂类药物的敏感性，这表明Dicer调节细胞周期的作用存在肿瘤类型特异性的差异。这可能和不同肿瘤存在miRNA的表达谱差异有一定的关系，这值得研究者进一步探索。

综上所述，我们的研究结果表明，沉默Dicer具有促进卵巢癌细胞A2780增殖和侵袭的能力，但仍需要进一步的体内试验证实。对Dicer在卵巢癌肿瘤形成中的作用及其机制的深入研究，将为临床治疗卵巢癌提供新的治疗靶点。

[1] Kumar MS, Lu J, Mercer KL, et al. Impaired microRNA processing enhances cellular transformation and tumorigenesis[J].Nat Genet，2007,39(5):673-677.

[2] Park D, Lee SC, Park JW, et al. Overexpression of miR-17 in gastric cancer is correlated with proliferation-associated oncogene amplification[J].Pathol Int,2014,64(7):309-314.

[3] Liu X, Yan S, Pei C, et al. Decreased microRNA-132 and its function in human non-small cell lung cancer[J].Mol Med Rep,2015,11(5):3601-3608.

[4] Gorenchtein M, Poh CF, Saini R, et al. MicroRNAs in an oral cancer context - from basic biology to clinical utility [J].J Dent Res,2012,91(5):440-446.

[5] Png KJ, Halberg N, Yoshida M, et a1. A microRNA regulon that mediates endothelial recruitment and metastasis by cancer cells [J].Nature,2011，481(7380):190-194.

[6] Cheng W, Liu T, Wan X, et a1. MicroRNA-199a targets CD44 to suppress the tumorigenicity and multidrug resistance of ovarian cancer-initiating cells[J].FEBS J，2012，279(11):2047-2059.

[7] Johnsnn SM, Grosshans H, Shingara J, et a1.RAS is regulated by the let-7 microRNA family[J].Cell,2005,120(5):635-647.

[8] Hayashita Y, Osada H, Tatematsu Y, et a1. A polycistronic microRNA cluster,miR-17-92, is overexpressed in human lung cancers and enhances cell proliferation[J].Cancer Res,2005,65(21):9628-9632.

[9] Tang KF, Song GB, Shi YS, et al. Dicer knockdown induces fibronectin-1 expression in HEK293T cells via induction of Egr1[J].Biochim Biophys Acta,1800(3):380-384.

[10]Han L, Zhang A, Zhou X, et al. Downregulation of Dicer enhances tumor cell proliferation and invasion[J].Int J Oncol，37(2):299-305.

Influence of RNA interference targeting Dicer on biological function of ovarian cancer cells

HEZhonghui1,LUFangfang2，XUHong1,WANGZehua3 ,CHIBo1,KUANGYan1*

(1DepartmentofGynecology,theFirstAffiliatedHospitalofGuangxiMedicalUniversity,Nanning,Guangxi530021,China；2theFirstAffiliatedHospitalofGuangxiMedicalUniversity,Nanning,Guangxi530021,China；3.DepartmentofObstetricsandGynecology,TongjiHospitalAffiliatedtoTongjiMedicalCollegeofHuazhongUniversityofScienceandTechnology,Wuhan,Hubei430022,China)

Objective To investigate the effect of inhibition of Dicer on the proliferation and migration of ovarian carcinoma cell A2780, thus to further specify the role of Dicer in biological behavior of ovarian cancer. Methods The synthetic Dicer small interfering(Dicer siRNA) was transfected into A2780 cells and the effective siRNA was selected. The expression of Dicer mRNA and protein were detected by real-time quantitative PCR and Western blot respectively.The growth and viability of cells were measured by MTT. Cellmigration was measured by Transwell chambers.Cell cycle was detected by flow cytometry.Results The expression of Dicer mRNA in the siRNA1658 transfected group (0.194±0.002)was the lowest compared with the non-transfected group, and was significantly lower than that in the siRNA1897 group(0.535±0.015), (P<0.001).But there was no statistical difference in the expression of Dicer mRNA between the siRNA1658 transfected group and the siRNA334 group(0.251±0.014) (P>0.05).The result of real-time quantitative PCR showed that the Dicer mRNA level of siDicer-A2780 cell relatively decreased (0.157±0.012) when the Dicer mRNA level of non-transfected A2780 cell was defined as 100%(P<0.001). Dicer protein level of siDicer-A2780 cell relatively decreased (0.153±0.021)when the Dicer protein level of non-transfected A2780 cell was defined as 100%(P<0.001). At the 3rd, 4th and 5th days,the proliferation of A2780 cells transfected by siDicer increased compared with the cells in the control group(allP<0.05). After 96 hours of transfection by siDicer, the proliferation activity of siDicer-A2780 cells increased by an average of 23% compared with the cells transfected by siNC in the control group.The result of cell cycle analysis showed that siDicer-A2780 cells at theG0/G1 phase, S phase and G2/M phase accounted for (44.26±0.48)%，(25.05±1.20)% and (21.53±0.77)% respectively. In the control group, siNC-A2780 cells at G0/G1 phase, S phase and G2/M phase accounted for (52.79±1.11)%，(20.01±1.22)% and (19.80±0.24)% respectively. The numbers of siDicer-A2780 cells at S phase and G2/M phase were more， but the number of cells at G0/G1 phase was less compared with the cells of the control group(P<0.001). Dicer-inhibited siDicer-A2780 cells penetrating membrane achieved (3.99±0.29)folds increase in the number compared to siNC-A2780 cells in the control group(P<0.001). Conclusion Dicer gene obtains the ability of inhibiting growth and invasion of ovarian cancer cells.

Ovarian cancer； Dicer gene；Cell proliferation；Cell invasion ；Therapy target

广西高校科学技术研究项目(编号：YB2014058 )，广西硕士研究生科研创新课题(编号：YCSZ2014101)

R 737.31

A

1673-6575(2017)04-0459-06

10.11864/j.issn.1673.2017.04.03

2017-04-23

2017-06-18)

*通信作者