长非编码RNA基因Z38对人乳腺癌细胞BT549生物学特性的影响

胡诗帆+邓日林+唐泽民+欧阳婧+孙园园+莫林波+张健+杨寅柯

摘 要 为探讨稳定干扰长非编码RNA基因Z38对乳腺癌细胞BT549的影响，向BT549细胞转染干扰Z38表达的慢病毒，经嘌呤霉素筛选获得稳定干扰的细胞，采用RT-PCR检测Z38的表达水平、MTT法检测细胞增殖及耐药性、克隆法检测细胞集落形成能力、碘化丙啶染色方法分析细胞周期、流式细胞术分析肿瘤干细胞标志物CD44和CD24的表达.结果表明，特异性的慢病毒能显著降低Z38表达水平，使细胞增殖能力、抗化疗药物能力及细胞集落形成能力显著降低，导致G2/M期细胞数目显著减少，细胞周期受阻，并且显著降低了CD44+/CD24-细胞群百分比而导致细胞的肿瘤干细胞特性降低.

关键词 Z38；人乳腺癌；细胞增殖；CD44+/CD24-

中图分类号 R737.9；R96文献标识码 A文章编号 1000-2537（2017）04-0034-06

Abstract The present study aimed at exploring the effect of stably interfering the long non-coding RNA gene Z38 on the biological behavior of human breast cancer cell line BT549. The lentiviral vector harboring RNAi sequence with the Z38 gene targeted was transfected into BT549 cells， and then screened by puromycin. The expression level of Z38 was determined by RT-PCR. Its cell viability and drug resistance were measured by MTT assay. The colony formation ability of cells was ascertained by cloning method. The cell cycle distribution was analyzed by propidium iodide staining. And the expression of CD44 and CD24 was examined by flow cytometry. Our results indicate that the expression level of Z38 was seriously inhibited by the specific lentiviral vector， which in turn effectively arrested the cell proliferation， drug resistance， colony formation ability， and cell number in G2/M stage. Moreover， our study shows that compared to the control group， the percentage of CD44+/CD24- cell was significantly decreased in the interference group， suggesting that the properties of cancer stem-like cells were markedly impacted.

Key words Z38； human breast cancer； cell proliferation； CD44+/CD24-

近年来，在原核生物、真核生物以及古细菌中发现许多ncRNA （non-coding RNA），它们在多个水平上调节基因的表达[1].人类基因组中有80%左右的基因能够被转录，而其中只有2%的序列编码蛋白质，超过90%是ncRNA[2-4]，说明ncRNA是基因组转录的主要产物.lncRNA（long non-coding RNA）是转录本超过200 bp，不具备开放阅读框的ncRNA序列.lncRNA的启动子相对更加保守，提示这些可能在生物体中发挥着重要的作用.lncRNA的异常表达与多种疾病相关，尤其是对肿瘤的发生、发展有着重要影响[5].

RNA干扰（RNA interference，RNAi）是一种转录水平上的基因隔断技术，具有高效性、特异性、选择性、快速性和可操作性等优点，在基因治疗中应用广泛，是现今沉默某些目标致癌基因的常用手段[6].慢病毒质粒载体系统安全性强、宿主细胞适用范围广，且转染效率高，可在细胞中长期稳定表达[7-8].采用慢病毒包装好的RNA干扰载体，可大大提高实验的可靠性，是目前最为有效的特异下调靶基因的干预手段[9].

本实验室前期研究中，通过比较乳腺癌[10-11]和正常乳腺组织的基因表达差异，发现了一个很有意义的编码ncRNA的基因，命名为Z38.Z38是一个762 bp的lncRNA.研究表明，Z38在乳腺癌中的表达很高，但在癌旁乳腺组织中表达很低（相差8～10倍）.此外，多种肿瘤细胞株及不同种类的肿瘤病人标本都检测出较高表达水平的Z38.本研究以lncRNA Z38为研究对象，考察其对人乳腺癌细胞BT549一些生物学特性的影响，为今后研究Z38在其他肿瘤细胞中的作用提供依据.

1 实验材料

人乳腺癌细胞BT549购自中科院上海细胞库.RPMI-1640 培养基购自美国 Hyclone公司；FCS（胎牛血清）购自美国 Hyclone公司；pGMLV-Z38-shRNA慢病毒载体系统由吉滿生物有限公司设计提供；嘌呤霉素盐酸盐购自意大利Bio Basic Inc公司；TRIzol RNA抽提试剂购自Thermo Fisher Scientific公司；cDNA逆转录试剂盒购自TaKaRa公司；MTT试剂购自鹏程生物科技有限公司；盐酸阿霉素购自湖北巨胜科技有限公司；细胞周期与凋亡检测试剂盒购自碧云天生物技术公司；藻红蛋白（PE）标记的鼠抗人CD44及多甲藻叶绿素蛋白（PerCP-Cy5.5）标记的鼠抗人 CD24单克隆抗体购自BD公司，其余均为国产分析纯试剂.

2 方法

2.1 细胞培养

乳腺癌BT549细胞用含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基，在37 ℃及5%CO2饱和湿度的细胞培养箱内培养，每2～3天更换新鲜培养基.

2.2 慢病毒转染

实验设空白对照组（blank control）、阴性对照组（pGMLV-scramble）及干扰组（pGMLV-Z38-shRNA）.将细胞以105个/孔铺板于6孔板，37 ℃及5%CO2条件下培养过夜.24 h后吸去细胞原有培养基，分别将细胞培养基（空白对照组）、阴性对照组病毒液、干扰组Z38-shRNA 病毒液，按照感染复数MOI（Multiplicity of Infection）=80稀释后加入细胞中，并加入Polybrene，在37 ℃及5%CO2条件下培养过夜，然后吸除含慢病毒的培养基，换为新鲜的培养基.

2.3 嘌呤霉素筛选感染细胞稳定株

在24孔板内以2×105 个/孔的密度铺板转染了慢病毒的细胞，37 ℃培养过夜后去除培养基，加入含3 mg/L嘌呤霉素的新鲜培养基，约每2～3天替换新鲜配制的筛选培养基，并每天检测细胞并观察活细胞生长比例、EGFP的表达，评估感染效率.

2.4 Real Time-PCR检测细胞Z38基因表达

分别提取经慢病毒筛选后的空白对照、阴性对照以及干扰组细胞的总RNA，通过RT-PCR检测细胞Z38基因的表达情况.GAPDH基因引物序列为F：5′-AACGGATTTGGTCGTATTGGG-3′，R：5′-CCTGGAAGATGGTGATGGGAT-3′.Z38基因引物序列为F：5′-AGTGGGATTGTGGAGACGGTGT-3′，R：5′-AGGTAAAAGGAACTGGCAACGC-3′.

2.5 MTT法检测RNA干扰对细胞增殖的影响

按照2×103个/孔将处于对数生长期细胞铺板48孔板，置于37 ℃及5%CO2饱和湿度的细胞培养箱内培养.在第1，3，5，7天分别每组取6孔，每孔加5 g/L MTT 20 μL，继续培养4 h，然后吸除原有培养液，每孔加 DMSO 150 μL，温和震荡10 min溶解紫色甲瓒，在酶标仪上测定490 nm波长下的吸光度（OD）值，以时间为横坐标、吸光度值为纵坐标绘制细胞生长曲线.细胞相对存活率=（实验组OD值/对照组OD值）×100%.

2.6 MTT法检测细胞经RNA干扰对阿霉素耐药性的影响

将细胞在含0.1 mg/L的阿霉素细胞培养基中培养3个月，并逐渐将阿霉素浓度提高到1 mg/L.细胞隔日更换新鲜培养基，每3～4天传代一次.耐药细胞初步诱导成功后，将细胞在无阿霉素的培养基中培养至少6个月，检测仍保持相似的耐药性且状态良好的细胞[12-13]，然后以2×104个/孔铺板48孔板，培养12 h后每孔加不同浓度梯度（1，2，3，5，10，20，30，50 mg/L）阿霉素，37 ℃培养48 h后用MTT法检测细胞在490 nm波长下的OD值.相对抑制率=（1-实验组OD值）/对照组OD值×100%.

2.7 克隆法检测 RNA干扰對细胞集落形成的影响

将指数生长期细胞反复吹打，使细胞充分分散制成单细胞悬液，再将细胞悬液浓度稀释至10个/mL，然后将细胞接种于96孔板，确保每孔1个细胞/100 μL培养基（若不是则剔除），置于37 ℃及5%CO2中培养2～3周，根据pH变化更换新鲜培养液.待培养皿中出现克隆（大于或等于50个细胞组成的细胞群作为一个克隆），弃去培养液，用甲醇固定15 min，弃甲醇后空气干燥，用Giemsa染液染色10 min、流水缓慢洗去染液、空气干燥.在倒置显微镜下计数克隆集落数.并计算细胞集落生长百分比，集落形成百分比=（克隆集落数/接种细胞数）×100%.

2.8 流式检测RNA干扰对细胞周期的影响

配置适量的碘化丙啶染色液（每3 mL染色缓冲液中加入碘化丙啶染色液（20×）150 μL，RNase A（50×）60 μL），4 ℃保存.收集乳腺癌BT549细胞并制成单细胞悬液（细胞数为105～106），离心弃上清，用预冷的PBS洗涤，再次离心弃上清，加入预冷的70%乙醇，4 ℃固定12 h，离心沉淀细胞，弃上清.每管细胞样品中加入0.5 mL碘化丙啶染色液，缓慢并充分重悬细胞，后在37 ℃避光温浴30 min，随后4 ℃或冰浴避光存放，用流式细胞仪在激发波长488 nm处检测红色荧光，结果用FlowJo 7.6软件处理.

2.9 流式检测RNAi对细胞表面标志物CD44/CD24表达量的影响

取对数生长期细胞消化重悬，过48 μm细胞筛，计数调整细胞浓度为2×105个/200 μL，每组分别设同型对照管、CD44单阳抗体管、CD24单阳抗体管、双阳抗体管，用流式分析仪检测每管细胞CD44+/CD24-细胞占总细胞的比例.

2.10 统计学处理

本实验所得数据采用 SPSS 19.0 for Windows 统计软件进行分析，P<0.05为差异有显著性意义.

3 结果

3.1 慢病毒转染乳腺癌BT549细胞情况

慢病毒感染细胞并经嘌呤霉素筛选后，在荧光显微镜下比较同一视野的细胞荧光照片和明场照片，显示其感染效率将近100%，如图1A所示（彩图见封三）.

3.2 慢病毒转染对乳腺癌BT549细胞Z38表达水平的影响

RT-PCR结果显示，BT549细胞经慢病毒转染后，干扰组的 Z38表达水平较阴性对照组与空白对照组均显著下调（P<0.05），而空白对照组与阴性对照组Z38基因表达水平无明显区别（P>0.05），如图1B.

3.3 干扰Z38表达对细胞增殖能力的影响

采用MTT实验检测Z38基因表达水平对细胞增殖能力的影响.由图2A可知，待培养第3天后，空白对照组、阴性对照组及干扰组细胞OD值开始出现明显区别，第5天三组OD值分别为0.322±0.006 6（空白对照组）、0.321±0.005 6（阴性对照组）、0.259±0.006 8（干扰组），其中干扰组细胞相对于阴性对照组细胞存活率达到80.7%.第7天的OD值分别为0.547±0.005 6（空白对照组）、0.557±0.008 7（阴性对照组），0.436±0.006 8（干扰组），其中干扰组细胞相对阴性对照组细胞存活率为78.3%.因此，干扰组与对照组细胞相比，增殖活性明显降低（P<0.05）.

3.4 干扰Z38表达降低细胞对阿霉素的耐药性

在含阿霉素的培养基作用48 h后，干扰组细胞增殖的抑制率明显高于对照组（P<0.05），见图2B，空白对照组和阴性对照组抑制率相比无统计学差异（P>0.05）.阿霉素浓度越高对细胞增殖的抑制效果越明显.

3.5 干扰Z38表达对细胞集落形成能力的影响

實验结果表明，空白对照组、阴性对照组、干扰组细胞集落形成百分比分别为21.2%，22.1%，9.8%，干扰组细胞的集落形成能力较阴性对照组明显降低（P<0.05），如图2C.

3.6 干扰Z38表达对BT549细胞周期的影响

流式细胞仪检测结果表明，空白对照组、阴性对照组和干扰组处于G2/M期的细胞比例分别为22.18%（图3A），23.87%（图3B），6.05%（图3C），其中干扰组处于G2/M期的干扰组细胞数量比重明显减少（P<0.05），且干扰组细胞主要在S-G2转换时受到抑制，见图3D.

3.7 干扰Z38表达对BT549细胞表达CD44+和CD24-的影响

采用流式细胞技术检测各组细胞中CD44+/CD24-细胞群百分比.干扰组CD44+/CD24-细胞群所占细胞百分比为6.20%（图4A），显著低于对照组细胞所占的12.30%（图4B），差异具有统计学意义（P<0.05）.

4 讨论

哺乳动物中，超过30 bp的dsRNA导致广泛的基因沉默现象，使特异性干扰目的基因变得十分困难.在RNAi研究中，可以采用直接转染人工合成的siRNA，还可以采用质粒或病毒载体介导的shRNA.人工合成的寡核苷酸siRNA和质粒介导RNAi均有一定的局限性，它们的转染效率较低、抑制持续时间较短.shRNA病毒载体的优势在于对目的细胞感染效率高和基因沉默效果稳定[14].目前，化疗仍是治疗乳腺癌的主要方法.阿霉素等蒽环类是临床常用的抗乳腺癌药物[15]，由于细胞耐药的产生，其临床应用受到很大限制[16-17]，寻求能提高乳腺癌化疗敏感性的方法是近年研究的热点.本研究结果显示，Z38-shRNA可以提高细胞对阿霉素的敏感性，从而降低肿瘤细胞的抗化疗耐药性.

Al-Hajj等[18]首次利用乳腺干细胞表型标志物（CD44+/CD24-）从人乳腺癌细胞中分离出乳腺癌干细胞.Shipitsin等[19]发现，CD44+/CD24-可以作为乳腺癌干细胞的标志物.该类群细胞是肿瘤发生、发展、转移、复发和耐药的关键.笔者的流式分析检测结果表明，在干扰组的细胞中，CD44+/ CD24-细胞群数目占细胞总数百分比明显下降，进一步说明干扰Z38基因能够一定程度地下调乳腺癌BT549细胞的肿瘤干细胞特性、侵袭转移及耐药能力[20].

本实验室前期研究证明Z38在乳腺癌标本、组织及细胞中的表达显著高于癌旁组织及细胞内的表达，将Z38基因克隆到质粒载体中转染乳腺细胞能够显著提高细胞增殖能力，并且利用Z38抑制剂能够引起高表达Z38基因的癌细胞凋亡.

本研究采用RNA干扰技术初步证实了干扰Z38基因能够抑制乳腺癌BT549细胞增殖能力和耐药性，并能够显著降低肿瘤干细胞的相关标志物的表达，从而抑制肿瘤细胞转移和再生.该研究结果为Z38基因作为乳腺癌基因治疗靶点，深入研究Z38的调控机制，阐明Z38在细胞增殖和凋亡中的作用机理，并确定Z38能否成为其他多发癌症（肝癌、肺癌、直肠癌、胃癌等）的抗癌靶点提供理论和实验依据.

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