火鸡禽霍乱的病原鉴定及病理学观察

么乃全 ， 邸海洋 ， 李新殿 ， 张 敏 ， 李斯齐 ， 高云航 ， 徐凤宇

(1.吉林农业大学动物科技学院 ， 吉林长春130118 ； 2.长春动植物公园 ， 吉林长春130400 ；3.吉林农业大学中药材学院 ， 吉林长春130118 ； 4.中国兽医药品监察所 , 北京海淀100081)

火鸡禽霍乱的病原鉴定及病理学观察

么乃全1， 邸海洋2， 李新殿3， 张 敏4， 李斯齐1， 高云航1， 徐凤宇1

(1.吉林农业大学动物科技学院 ， 吉林长春130118 ； 2.长春动植物公园 ， 吉林长春130400 ；3.吉林农业大学中药材学院 ， 吉林长春130118 ； 4.中国兽医药品监察所 , 北京海淀100081)

对长春某观赏动物园区疑似急性禽霍乱的火鸡病例进行实验室诊断，病原经染色鉴定为革兰阴性两极浓染的球杆菌，进一步16S rRNA序列测定与分析显示，该病原为多杀性巴氏杆菌。病理组织学观察可见火鸡肝脏淤血、细胞坏死；小肠呈卡他性出血性肠炎；肺脏充血、间质增宽，符合禽霍乱病理组织学特点。药敏试验显示，该菌对阿米卡星、米诺环素、头孢哌酮、庆大霉素敏感，采用敏感抗生素注射结合严格消毒措施控制了该病的发生和蔓延。

火鸡 ； 多杀性巴氏杆菌 ； 鉴定 ； 病理学

禽霍乱是由多杀性巴氏杆菌引起禽类的一种败血性、致死性传染病，能感染所有禽类且多为致死性感染。该病仍是危害我国养禽业的主要细菌性疫病之一，发病率为10%～70%，病死率30%～80%[1]。健康携带病原或感染的禽类均是重要的传染源[2]。成年火鸡的易感性最高，发病最为严重，国内禽霍乱病例主要见于鸡、鸭和鹅，关于火鸡发生禽霍乱的报道较少[3]。

2014年8月长春市某观赏动物园区内5只火鸡相继发生急性死亡，其中2只于夜间死亡，3只清晨见有精神委靡、不食、羽毛蓬乱的表现，于中午前后相继死亡。为了确诊该病，对死亡火鸡进行病理剖检、病原分离鉴定及病理组织学观察，确定引起此次疫情的病原为多杀性巴氏杆菌。

1 材料与方法

1.1 主要试剂 犊牛血清，购自浙江天杭生物技术有限公司；TSA、TSB培养基，均为北京奥博星生物技术责任有限公司产品；细菌基因组DNA提取试剂盒，购自天根生化科技(北京)有限公司；PCR反应预混液、DNA Marker、DNA纯化回收试剂盒，购自宝生物工程(大连)有限公司；革兰氏、美蓝染色液均为实验室自行配制保存；苏木素-伊红染色试剂盒，购自武汉博士德生物工程有限公司；其他化学试剂均为国产分析纯试剂。

1.2 菌株 多杀性巴氏杆菌C48-11(Pasteurellamultocida，CVCC 462)，购自中国兽医药品监察所。待鉴定的疑似火鸡多杀性巴氏杆菌命名为PmccTk-1。

1.3 药敏纸片 庆大霉素、卡那霉素、米诺环素、多西环素、新霉素、红霉素、头孢氨苄、头孢拉啶、哌拉西啉、羧苄西啉、苯唑西啉、阿米卡星、氨苄西林、头孢哌酮、头孢曲松、四环素、青霉素、头孢唑啉、头孢他啶、阿奇霉素、多粘菌素B的药敏纸片，均购自杭州天和微生物试剂有限公司。

1.4 病鸡剖检 按照常规剖检术式进行，心血及肝脏组织触片制作均在超净工作台中进行，革兰染色、美蓝染色参照《兽医微生物实验诊断手册》方法进行[4]。

1.5 病原分离培养 无菌采集病死鸡的心血、肝脏，划线接种于含10%犊牛血清的TSA平板培养基，于37 ℃恒温培养箱中培养，12 h后观察结果。

1.6 药敏试验 经10%血清TSB培养基增菌培养后的菌液，均匀涂布于TSA平板培养基，37 ℃恒温培养箱中孵育1 h，用无菌镊子将药敏纸片贴于培养基表面，24 h后测量抑菌圈直径。

1.7 16S rRNA基因序列分析 参照试剂盒方法提取细菌基因组DNA，16S rRNA通用引物(27F: 5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′/1492R：5′-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′)进行目的基因的PCR扩增。方法参照文献[5]，预期片段大小约为1 500 bp，测序后与GenBank中公布的基因序列进行比对分析。

1.8 病理组织学检查 采集病死火鸡心、肝、肺和肠等组织经10%福尔马林固定，常规石蜡制片、H.E.染色，供病理组织学检查。

2 结果

2.1 病理剖检结果 死亡火鸡的剖检病理特征十分相似，胸腔壁和腹膜可见大量出血斑点；心包淡黄色积液，心外膜及心冠脂肪有出血斑点(见封二彩版图1)；肝脏肿大，表面有大量灰白色坏死斑点(见封二彩版图2)；肺部充血、水肿(见封二彩版图3)；腺胃乳头间大量出血点(见封二彩版图4)；十二指肠高度充血、出血、水肿，肠腔内大量胶胨样凝血块(见封二彩版图5)；气管中积有多量黏液，黏膜散在出血点；睾丸充血、肿大(见封二彩版图6)。

2.2 病料涂片染色鉴定结果 病死火鸡心血、肝脏涂片经革兰染色镜检可见红色球杆菌(见封二彩版图7)，美蓝染色镜检可见两端着色短小杆菌(见封二彩版图8)，符合巴氏杆菌的染色特征。

2.3 病原分离鉴定结果 在TSA培养基上可见面光滑、透明的、露滴状小菌落，革兰、美蓝染色镜检结果与病料染色结果一致。

2.4 16S rRNA序列测定及分析 扩增的16S rRNA基因序列与GenBank中已公布基因序列进行Blast比对，MegAlign软件分析结果如图13所示，与C48-11等几种禽源多杀性巴氏杆菌的同源性均在98%以上，参照相关文献的报道[6]，可以确定该菌株为多杀性巴氏杆菌。

图13 火鸡巴氏杆菌16S rRNA序列同源性分析

1:PmccTk-1; 2:CVCC C48-11; 3:HPs-1; 5:NCTC 10204; 6:HIM830-7T; 7:PM106; 8:HaiNGoosePm2012

2.5 病理组织学观察结果 肝脏静脉淤血、扩张，管腔与窦内充有大量红细胞，部分肝细胞坏死，胞核溶解、空泡化(见封二彩版图9)；心肌纤维断裂、崩解，部分胞核消失，间质中存在红细胞和白细胞浸润(见封二彩版图10)；小肠黏膜固有层明显充血、出血，白细胞浸润，肠黏膜上皮细胞坏死脱落，呈卡他性出血性肠炎(见封二彩版图11)；肺脏中小静脉扩张充血，间隔增宽，可见多量白细胞浸润(见封二彩版图12)。

2.6 药敏试验结果 结果显示，该菌株对卡那霉素、多西环素、新霉素、红霉素、头孢氨苄、头孢拉啶、哌拉西啉、羧苄西啉、苯唑西啉、氨苄西林、头孢曲松、四环素、青霉素、头孢唑啉、头孢他啶、阿奇霉素、多黏菌素B表现出不同程度的耐药性；而对阿米卡星、米诺环素、头孢哌酮、庆大霉素较为敏感。

3 讨论

此次火鸡发生禽霍乱的病程短、病死率高，濒死前的临床特征不明显，剖检病理变化却较典型，符合禽霍乱病变特点。病原经实验室分离鉴定和16S rRNA序列鉴定进一步证实为多杀性巴氏杆菌。病理组织学观察可见火鸡肝脏淤血、细胞坏死；心肌纤维断裂，白细胞浸润；小肠黏膜固有层充血、出血，呈卡他性出血性肠炎；肺脏充血、间质增宽。符合禽霍乱的病理组织学特点。

该园区火鸡在发生禽霍乱前一直于舍内饲养，转到室外的饲养区周围为其他观赏禽类，推测此次禽霍乱的暴发很可能是由其他观赏禽类传播所致。火鸡在饲养过程中未曾进行过疫苗免疫，也未投喂过各种抗菌药物，从而导致急性感染的发生。通过敏感抗生素注射结合严格的消毒措施，此次疫情得到了控制。

火鸡对多杀性巴氏杆菌的易感性极高，发病多为最急性感染，具有很高的致死率，因此在火鸡养殖中应十分注意禽霍乱的防控。若有条件可用地区流行的血清型多价灭活疫苗或自家灭活疫苗进行免疫预防，同时应注意不能与家禽混养，防止家禽携带病原发生传播，动物观赏园区注意火鸡不与其他观赏禽类混养。

[1] 施少华, 程龙飞, 傅光华，等. 检测禽多杀性巴氏杆菌PCR方法的建立[J]. 福建农业学报, 2009, 24(3): 201-204.

[2] Christensen J P, Bisgaard M. Fowl cholera[J].RevSciTech, 2000, 19(2): 626-637.

[3] 廖素环, 韦天超, 骞慧，等. 一起火鸡禽霍乱的诊治[J]. 养禽与禽病防治, 2011, 8:36-37.

[4] 么乃全, 王全凯, 姜秀云，等. 鸭疫里氏杆菌外膜微孔蛋白基因的克隆和序列分析及PCR检测方法的建立[J]. 中国兽医科学, 2013, 43(07):723-727.

[5] 廖延雄. 兽医微生物实验诊断手册[M]. 北京: 中国农业出版社, 1995:59-61.

[6] Fry N K, Warwick S, Saunders N A,etal. The use 16S ribosomal RNA analyses to investigate phylogeny of the familyLegionellaceae[J].JGenMicr-obiol, 1991, 137(5):1 215-1 222.

Pathogen Identification and Pathological Observation of Turkey Fowl Cholera

YAO Nai-quan1, DI Hai-yang2, LI Xin-dian3, ZHANG Min4, LI Si-qi1, GAO Yun-hang1, XU Feng-yu1

(1.College of Animal Science and Technology, Jilin Agricultural University, Changchun 130118, China; 2.Changchun Animal and plant park, Changchun 130061, China; 3.College of Chinese Medicinal Materials, Jilin Agricultural University, Changchun 130118, China; 4. China Institute of Veterinary Drug Control, Beijing 100081，China)

Laboratory diagnosis was carried out for turkeys of an ornamental zoo in Changchun suspected acute fowl cholera by clinical diagnosis. The microscopic examination of isolated pathogen showed that it was a kind of small Gram negative bacilli with bipolar staining characteristics. 16S rRNA sequence analysis indicated the strain wasPasteurellamultocida. Histopathological observation consist with characteristics of fowl cholera with liver congestion and cell necrosis, catarrhal hemorrhagic enteritis, lung congestion and interstitial width increased. Susceptibility test showed the strain was sensitive to amikacin, minocycline, cefoperazone, gentamicin. Disease outbreak was controlled by sensitive antibiotic injection combined with strict disinfection measures.

Turkey ;Pasteurellamultocida; Identification ; Pathology

XU Feng-yu

2016-03-04

吉林农业大学博士启动基金项目(201405)；吉林省教育厅“十三五”科学技术研究项目(2016192)

么乃全(1980-)，男，讲师，博士生，从事动物传染病诊断及免疫研究，E-mail:ynq1980@163.com

徐凤宇，E-mail: xvfengyv2002@126.com

S832

A

0529-6005(2017)07-0045-02