玉屏风多糖体外抗新城疫病毒效果的研究

戴超月 ， 蒋焱平 ， 郭 彦 ， 刘雨桐 ， 杨 鸿 ， 计慧琴 ， 邓 桦

(佛山科学技术学院动物医学系, 广东佛山528231)

玉屏风多糖体外抗新城疫病毒效果的研究

戴超月 ， 蒋焱平 ， 郭 彦 ， 刘雨桐 ， 杨 鸿 ， 计慧琴 ， 邓 桦

(佛山科学技术学院动物医学系, 广东佛山528231)

以新城疫病毒(NDV)感染鸡胚和鸡胚成纤维细胞，探索玉屏风多糖(Yupingfeng polysaccharides YPF-P)及其含药血清的抗病毒效果。SPF兔采用500 mg/kg体重YPF-P灌服给药，于第1、3、5、7天采集全血，制备不同浓度含药血清；培养SPF鸡成纤维细胞(CEF)，分别加入不同浓度的YPF-P及其含药血清，进行细胞毒性试验；采用先加多糖后加病毒、先加病毒后加多糖、多糖和病毒感作后同时加入的3种给药方式，观察YPF-P及其含药血清对病毒的阻断、抑制和直接杀灭作用。结果与正常对照组相比，不同浓度YPF-P(0.625、1.25、2.5、5、10 mg/mL)和7 d的YPF-P含药血清的CEF细胞活性均显著增强(P<0.05或P<0.01)。CEF培养24 h后，YPF-P抑制病毒作用明显，与NDV对照组相比差异极显著(P<0.01)；3种给药方式与NDV对照组相比，含药血清组细胞活性均极显著升高(P<0.01)。表明YPF-P及其含药血清均对CEF无毒副作用，且可显著增强细胞活性；YPF-P及其含药血清有较好的抑制病毒毒性的作用。

玉屏风多糖 ； 含药血清 ； 细胞活力 ； 抗病毒

多糖类药物具有治疗功能全面，覆盖面广泛的优势，所产生的毒害性作用小，有害残留少[1]。据相关研究表明，YPF-P能促使人与动物胸腺、脾脏等免疫器官的生长发育，增强免疫细胞的活性，提高各种疫苗的接种效果以及延迟抗体的持续时间，可免疫调节功能，并促进机体免疫球蛋白的形成[2-3]。YPF-P还能有效提高佐剂性关节炎大鼠的T细胞亚群数，显著促进小鼠腹腔的巨噬细胞吞噬功能、脾淋巴细胞增殖、相关迟发型超敏反应以及溶血素抗体生成等[4-5]。但是，目前YPF-P体外抗病毒的研究尚不多见。本文提纯YPF-P，制备不同浓度的YPF-P及其含药血清，以NDV感染鸡胚和鸡胚成纤维细胞探索YPF-P及其含药血清的体外抗病毒效果，为中药多糖含药血清的临床应用打下理论基础。

1 材料与方法

1.1 制备YPF-P 将药粉黄芪、防风和白术按质量比3∶1∶1配制成的玉屏风散，置于1 L的圆底烧瓶中，通过水提取，过滤加热浓缩，醇提纯，最后经过真空冷冻干燥机在低温下制成粉末状的精制YPF-P，分装后4 ℃保存备用。

1.2 制备YPF-P含药血清 12只SPF新西兰兔随机分2组，给药组灌胃YPF-P 500 mg/kg体重·d;对照组灌服等体积的生理盐水；1次/d，共7 d，最后1次给药1 h 后心脏采血，37 ℃静置1 h后放4 ℃冰箱过夜，5 000 r/min 离心5 min，取血清同组合并后，56 ℃ 灭活30 min，0.22 μm 滤过除菌，-20 ℃保存备用。

1.3 ND病毒的检测

1.3.1 ND病毒复壮 9日龄的SPF鸡胚15只，每只注射0.2 mL新城疫原胚液，37 ℃恒温箱中孵育，间隔12 h检查1次，收集24～72 h死亡鸡胚的尿囊液，0.22 μm过滤，-80 ℃保存。

1.3.2 NDV半数致死量 准备11个10 mL EP管，在第1管中加入1 mL的已复壮的胚液，2～11管用移液枪各加入0.9 mL生理盐水，用100 μL移液枪从第1管吸取出0.1 mL试液转移到第2管(移液枪在第2管时反复吹打几次，混合试液)，从第2管中吸取出0.1 mL到第3管，重复上述步骤直到第11管，最后除去0.1 mL试液。浓度分别为1∶1、1∶10～1∶1010。将SPF鸡胚分成11组，每组6个，接种病毒液2 mL/只,72 h后，检查并记录鸡胚死亡数量，计算NDV鸡胚半数致死量。

1.4 测定项目和方法

1.4.1 CEF原代培养 9日龄的SPF胚蛋，通过取材、剪材、消化、制备CEF细胞悬液、加入10%胎牛血清，置于37 ℃、饱和湿度的5 %CO2培养箱内培养。

1.4.2 YPF-P及其含药血清细胞活性检验 鸡胚成纤维细胞传代培养12 h后，按照表1、表2加入不同浓度的YPF-P及其含药血清，除空白对照组仍然加入10%的胎牛血清外，为尽量减少胎牛血清对试验结果的干扰，其余各试验组均加入2%胎牛血清维持细胞生长。采用MTT法检测，在全自动酶标仪上比色(波长490 nm)。以观察YPF-P及其含药血清对CEF的影响，并筛选出最佳作用剂量。

表1 YPF-P细胞活性检验的给药剂量及分组 (n=16, mg/mL)

表2 YPF-P含药血清细胞活性检验的给药剂量及分组 (n=16, mg/mL)

1.4.3 YPF-P及其含药血清体外抗NDV研究 根据1.4.2结果，选择YPF-P及其含药血清的最佳作用剂量，以3种不同加药方式研究其抗病毒效果，具体分组见表3。

表3 YPF-P及其含药血清体外抗NDV的试验分组 (n=16)

2 结果

2.1 ND病毒的检测结果 11组鸡胚，在72 h内均有不同程度的死亡。其中将病毒1∶107倍稀释时，接种鸡胚(0.2 mL/个)首先可使50%鸡胚死亡，因此确定NDV半数致死浓度为1∶107。

2.2 YPF-P及其含药血清对CEF活性的影响

2.2.1 YPF-P对CEF活性的影响 YPF-P提纯率为88.9%。不同浓度的YPF-P(0.625、1.25、2.5、5、10 mg/mL)之间无显著差异(P>0.05)，与正常对照组相比差异极显著(P<0.01)，鸡胚成纤维细胞活性显著增强。见图1。

图1 不同YPF-P剂量对CEF活性的影响注：大写字母不同者表示P<0.01

2.2.2 YPF-P含药血清对CEF活性的影响 结果可见，不同剂量的含药血清组之间，细胞活性差异极显著(P<0.01)，但第7 天含药血清组与胎牛血清组之间无差异(P>0.05)。见图2。

图2 不同天数含药血清对CEF活性的影响注：大写字母不同者表示P<0.01

2.3 YPF-P及其含药血清体外抗NDV研究

2.3.1 YPF-P体外抗NDV结果 由图3可见，阳性YPF-P对照组细胞活性最高，阴性ND病毒对照组、杀灭作用组和阻断作用组细胞活性最低。经方差分析，正常胎牛血清对照组细胞活性与杀灭作用组、阻断作用组和阴性对照组差异极显著(P<0.01)。3种加样方式之间差异极显著(P<0.01)，且抑制作用组细胞活性显著高于杀灭作用组、阻断作用组。阴性对照组与杀灭作用组、阻断作用组之间无显著差异(P>0.05)，说明多糖对病毒没有杀灭和阻断作用。阳性YPF-P对照组与其他各组之间差异极显著(P<0.01)，细胞活性最高，且显著高于正常对照组。

图3 YPF-P体外抗NDV对细胞活力的影响注：大写字母不同者表示P<0.01

2.3.2 YPF-P含药血清体外抗NDV结果 由图4可见，阳性YPF-P含药血清组细胞活性最高，与正常对照组差异显著(P<0.01或P<0.05)，与其他各组差异极显著(P<0.01)。阴性对照组、杀灭作用组、阻断作用组的细胞活性最低。正常胎牛血清组细胞活性与杀灭、抑制、阻断、阴性组相比，差异极显著(P<0.01)，阴性对照组与杀灭作用组、阻断作用组之间无显著差异(P>0.05)，说明YPF-P含药血清对病毒没有杀灭和阻断作用。3种加样方式之间抑制作用组细胞活性显著高于杀灭、阻断作用组，差异极显著(P<0.01)。

图4 YPF-P含药血清体外抗NDV对细胞活力的影响注：图中小写字母不同者表示P<0.05; 大写字母不同者表示P<0.01

3 讨论

3.1 YPF-P及其含药血清的细胞活性试验 从图1中可知，不同浓度的YPF-P试验组的细胞活性均比胎牛血清对照组的细胞活性高，各试验组之间的细胞活性差异不显著，随着YPF-P浓度增加，细胞活性并没有规律性升高或降低，表明YPF-P虽然对细胞活性有显著提高作用，但是并不随多糖浓度剂量的变化而提高或降低。

从图2中可知，不同剂量的含药血清组之间，细胞活性随着浓度的增加而升高，第7 天的含药血清组的细胞活性与胎牛血清组之间无显著差异，说明高浓度含药血清对CEF无明显毒副作用。

3.2 YPF-P及其含药血清体外抗NDV效果 在YPF-P试验中，结果提示感染初期病毒毒力较强，YPF-P仅对病毒有一定抑制作用，无明显的杀灭、阻断作用。YPF-P可能与细胞膜表面的病毒吸附蛋白受体结合[6]，并且在一定程度上阻止病毒的吸附和进入。

CEF继续培养24 h后，YPF-P对病毒有明显的抑制作用，但是杀灭和阻断作用不明显。说明其抗病毒作用主要是通过与细胞膜表面的病毒吸附蛋白受体结合或改变病毒吸附蛋白受体来保护细胞而实现的，而并非直接杀灭病毒，而病毒一旦侵入并破坏细胞后，多糖亦不能提高细胞的抗感染能力。

在YPF-P含药血清3种加样方式试验中，培养24 h后，发现YPF-P含药血清对ND病毒也无明显的杀灭和阻断作用，确有极显著的抑制作用。阳性对照组和正常对照组相比，YPF-P含药血清对细胞生长有显著的促进作用。

由本试验结果可知，YPF-P及其含药血清均对细胞无毒副作用，均可显著增强细胞活性；YPF-P能够阻断NDV的吸附和进入，对鸡胚成纤维细胞有较好的保护作用；YPF-P含药血清不但可阻断NDV对鸡胚成纤维细胞的吸附和侵入，还可较好的抑制病毒的毒性。

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[3] 邓桦，杨鸿，仝锡瑶，等.玉屏风多糖对免疫抑制小鼠红细胞免疫功能的影响[J].中国兽医杂志，2016,52(2)：56-58.

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[5] 杨鸿，陈杖榴，邓桦，等. 玉屏风多糖对免疫低下小鼠血清IL-2和IFN-γ含量的影响[J]. 安徽农业科学，2014，42(12)：3 571-3 572.[6] 杨鸿，陈杖榴，邓桦，等.加味玉屏风散对鸡红细胞免疫和自由基的影响[J].中国兽医科学，2006,36(01)：70-73.

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Study the antiviral effect of Yupingfeng Polysaccharides on Vitro

DAI Chao-yue ， JIANG Yan-ping , GUO Yan ， LIU Yu-tong ，YANG Hong ， JI Hui-qin ， DENG Hua

(Department of Veterinary Medicine,Foshan University, Foshan 528231,China)

To explore the antiviral effect of YPF-P and drug-containing serum-on chicken embryo and CEF infected by NDV. SPF rabbits was drenched with YPF-P (500 mg/kg), the blood sample were collect at 1,3,5,7 days, and the different concentrations of medicated sera were prepared. To do cell toxicity experiments the SPF chicken fibroblasts were cultivated with different concentrations of YPF-P and drug-containing serum. For three ways to medicine the virus was first added，the virus was added before adding polysaccharide or the mixed of polysaccharide and virus was added. Then we observed the effect of YPF-P and drug-containing serum on blocking, killing and restraining virus effect.Compared with normal control group, different concentrations of YPF-P (0.625, 1.25, 2.5, 5, 10 mg/mL) and YPF-P drug-containing serum (7 d) of CEF activity were enhanced significantly(P<0.05 orP<0.01).After 24 h, compared to NDV control group,YPF-P inhibits the virus extremely significant (P<0.01);three ways of medicine compared with NDV control group, cell activity of drug-containing serum groups were increased significantly(P<0.01). YPF-P and drug-containing serum were non-toxic on CEF, and can enhance cell activity significantly ;YPF-P and drug-containing serum has good inhibition of the toxic effects of the virus.

YPF-P ; CEF ; NDV ; YPF-P drug-containing serum ; cell activity

DENG Hua

2016-09-14

广东省科技计划项目(2016A020210140);国家级大学生创新创业训练计划项目(201411847008)

戴超月(1992-)，男，硕士生，主要从事分子病理学研究，E-mail: 13434818703@163.com

邓桦，E-mail: denghuatt@163.com

S852.65+9.5

A

0529-6005(2017)07-0030-03