P16蛋白、HPV L-1壳蛋白在CIN和早期宫颈癌组织中的表达及其筛查价值

项媛媛,王苗苗,谢 艳,袁智民

(扬州大学医学院附属淮安市妇幼保健院妇产科，江苏 淮安226600)

P16蛋白、HPV L-1壳蛋白在CIN和早期宫颈癌组织中的表达及其筛查价值

项媛媛,王苗苗,谢 艳,袁智民

(扬州大学医学院附属淮安市妇幼保健院妇产科，江苏 淮安226600)

目的 分析P16蛋白、人乳头瘤病毒(HPV)L-1壳蛋白在宫颈上皮内瘤变(CIN)和宫颈癌中的表达及筛查价值。方法 选取2014年1月至2016年6月淮安市妇幼保健院妇产科CIN和早期宫颈癌共50例患者，通过第二代杂交捕获法与免疫组化法分析P16蛋白、HPV L-1壳蛋白在其组织中的表达。结果 P16蛋白在慢性宫颈炎(9.09%)、低度鳞状上皮内病变(52.94%)、高度鳞状上皮内病变(84.21%)及早期宫颈癌(100.00%)中的阳性表达率逐渐升高(χ2=45.38，P=0.00)，人乳头瘤病毒 L-1壳蛋白阳性表达率亦存在明显差异，分别是18.18%、35.29%、15.79%及0(χ2=12.59，P=0.00)；随着病毒载量提高，P16蛋白与人乳头瘤病毒L-1壳蛋白阳性表达率均有所改变(χ2值分别为41.37、32.95，均P<0.01)。在慢性宫颈炎中，P16蛋白表达阳性率与高危型人乳头瘤病毒呈正相关关系(r=0.52，P=0.01)；在低度鳞状上皮内病变中，P16蛋白、人乳头瘤病毒L-1壳蛋白阳性表达率与高危型人乳头瘤病毒均呈正相关关系(r值分别为0.58、0.33，均P<0.05)；在高度鳞状上皮内病变及早期宫颈癌中，P16蛋白、人乳头瘤病毒L-1壳蛋白阳性表达率与高危型人乳头瘤病毒均未存在显著相关性(r值分别为0.12、0.26、0.62，均P>0.05)。结论 P16蛋白、人乳头瘤病毒L-1壳蛋白表达阳性可作为宫颈癌前病变出现的分子事件，在筛查CIN和早期宫颈癌中的价值较高，临床上值得应用和推广。

高危型人乳头瘤病毒；P16蛋白；人乳头瘤病毒 L-1壳蛋白；宫颈上皮内瘤变；宫颈癌

宫颈癌是继乳腺癌之后的一种发病率较高的恶性肿瘤，临床研究报道，近几年宫颈癌多发于年轻女性且发病率逐年上升，给女性群体的健康及生活水平带来极大的影响[1]。人乳头瘤病毒(human papillomavirus，HPV)是乳多空病毒科的乳头瘤空泡病毒A属之一。已有学者表示，宫颈上皮内瘤变(cervical intraepithelial neoplasia，CIN)及宫颈癌的出现及发展与感染高危型人乳头瘤病毒(high-risk human papillomavirus，HR-HPV)有着一定的联系[2]。P16蛋白与HPV L-1壳蛋白在宫颈病变中的诊断价值较高，然而有关其与HPV载量问题的研究相对较为少见。因此，现就扬州大学医学院附属淮安市妇幼保健院CIN及早期宫颈癌患者进行探讨，分析P16蛋白、HPV L-1壳蛋白在其组织中的表达与筛查价值。

1资料与方法

1.1一般资料

随机选取淮安市妇幼保健院妇产科2014年1月至2016年6月50例非典型鳞状上皮细胞(atypical squamous cells of undetermined significance，ASCUS)以上病变程度的患者，年龄为31.54±7.66岁，所有患者既往均有性生活史，排除外阴道假丝酵母菌、妊娠和阴道毛滴虫等病原体感染，同时排除宫颈环切术史或全子宫切除术史。宫颈组织病理学检查结果有CIN、良性细胞变化及鳞状细胞癌(squamous cell carcinoma，SCC)，其中，CINⅠ对应液基细胞学检查(thin-prep cytologic test，TCT)中的低度鳞状上皮内病变(low-grade squamous intraepithelial lesion，LSIL)，CINⅡ、CIN Ⅲ对应TCT检查中的高度鳞状上皮内病变(higher-grade squamous intraepithelial lesion，HSIL)。病理组织学呈阳性主要有SCC、CINⅠ、CINⅡ以及CIN Ⅲ。本次研究50例患者中有11例慢性宫颈炎、36例CIN以及3例早期宫颈癌。

1.2检测方法

1.2.1试剂选用

P16多克隆抗体与SP试剂盒均来自武汉默沙克生物科技有限公司；第二代杂交捕获试剂盒来自北京洛奇临床检验所有限公司；CytoReact HPV L1检测试剂盒来自美国Advanced Medical Science公司。

1.2.2 P16蛋白检测

通过免疫组化SP法，染色方法均根据试剂盒指示完成操作。若胞浆与细胞核产生棕褐色亦或棕黄色颗粒则提示阳性。于病变细胞密集处，在40×10倍光镜下观察5个视野，全部视野均计数50个细胞，根据阳性细胞数与分布进行判断：阳性细胞比例低于5%是(-)；5%～25%之间是(+)；26%～50%之间是(++)；高于50%是(+++)[3]。

1.2.3 HPV L-1壳蛋白

分别通过免疫组化与原位杂交法进行检测操作，检测方法均根据试剂盒指示完成；若超过1个被红染的细胞核则提示HPV L1表达阳性。

1.2.4 HPV病毒载量检测

通过第二代杂交捕获法，将所选样本中的相对发光单位与标准阳性参照临界值的比值作为反映该检测样本中HPV-DNA的含量情况，能够检出HPV31、35、51、59等13种HR-HPV DNA病毒载量；若二者比值在1及以上则提示表达阳性，可将其载量分成<1、>1～100、>100～1 000及>1 000共4个不同等级[4]。

1.3统计学方法

2结果

2.1 P16蛋白、HPV L-1壳蛋白在不同病变程度宫颈组织中的表达

在慢性宫颈炎组织中，P16蛋白阳性细胞较为少见，以底层细胞分布为主，且主要为浅染色；P16蛋白阳性细胞在CIN组织中主要见于病变细胞层，染色相对较深，同时随着CIN病变程度的加重，P16蛋白阳性细胞分布范围有所扩大，染色越深，颗粒越大，以灶状或弥漫分布为主；P16蛋白阳性细胞在不同病变程度宫颈组织中的表达存在明显差异(P=0.00)。HPV L-1壳蛋白主要见于细胞核，阳性细胞中胞核以红褐色颗粒为主，且集中于表层细胞；HPV L-1壳蛋白在不同病变程度宫颈组织中的表达亦存在明显差异，其中在LSIL中的表达阳性率最高(P=0.00)，见表1。

表1 P16蛋白、HPV L-1壳蛋白在不同病变程度宫颈组织中的表达[n(%)]

Table 1 Expressions of P16 and HPV L-1 caspid in various cervical lesions[n(%)]

2.2 HR-HPV在不同病变程度宫颈组织中的载量分布及P16蛋白、HPV L-1壳蛋白表达

在慢性宫颈炎、LSIL、HSIL中，HR-HPV阳性表达率逐渐上升，分别是36.36%、88.24%、94.74%(χ2=69.14，P=0.00)，在早期宫颈癌中的表达阳性率为66.67%；随着HPV载量提高，P16蛋白与HPV L-1壳蛋白阳性表达率均有所改变(χ2值分别为41.37、32.95，均P<0.01)，见表2。

表2 HR-HPV在不同病变宫颈组织中的载量分布及P16蛋白、HPV L-1壳蛋白表达[n(%)]

Table 2 HR-HPV load and expressions of P16 and HPV L-1 caspid in various cervical lesions [n(%)]

2.3 P16蛋白、HPV L-1壳蛋白在各宫颈病变组织中的表达与HR-HPV载量相关性分析

在慢性宫颈炎中，P16蛋白表达阳性率与HR-HPV呈正相关关系(P=0.01)；在LSIL中，P16蛋白、HPV L-1壳蛋白阳性表达率与HR-HPV均呈正相关关系(均P<0.05)；在HSIL及早期宫颈癌中，P16蛋白、HPV L-1壳蛋白阳性表达率与HR-HPV均未存在显著相关性(均P>0.05)，见表3。

表3 P16蛋白、HPV L-1壳蛋白在各宫颈病变组织中的表达与HR-HPV载量相关性

Table 3 Correlation between expressions of P16 and HPV L-1 caspid and HR-HPV load in various cervical lesions

3讨论

3.1 CIN及预防宫颈癌的一般手段

HR-HPV反复感染是导致CIN及宫颈癌出现和发展的主要原因[5]，故其能够在临床上对CIN以及宫颈癌患者做出及时诊治提供关键性依据。由于我国作为宫颈癌多发的国家之一，目前对其诊治方法采用尽早诊断并治疗其癌前病变的做法。TCT技术与电子阴道镜的检查手段因其有着显著的无创性及检测敏感性，均已日渐作为临床宫颈癌检查的常规手段之一。另一方面，CIN的生物学行为并不是呈现单纯的发展趋势，较多的CIN可能会呈现长时间停滞或消退的状态，然而由于未能够找出其转归预测的形态学依据，造成临床中出现部分CIN患者治疗不当的情况。故此，积极研究可以科学预测CIN转归的形态学指标逐渐成为临床探索的重要课题。

3.2HR-HPV感染与CIN和宫颈癌出现、发展的联系

研究报道指出，HR-HPV感染与CIN及宫颈癌的出现和发展有着极大的关系，生殖道HPV反复感染会直接引起CIN等不同程度病变的出现；若病毒不断感染则很大有可能引起宫颈癌[6]。本实验50例患者中有11例慢性宫颈炎患者、17例LSIL患者、19例HSIL患者以及3例早期宫颈癌患者。在慢性宫颈炎、LSIL、HSIL中，HR-HPV阳性表达率逐渐上升，分别是36.36%、88.24%、94.74%，在早期宫颈癌中的表达阳性率为66.67%。研究结果表明，CIN及宫颈癌的出现与HR-HPV感染有着密切的联系；同时随着病情程度的恶化，其阳性率呈现显著上升的趋势。其中，早期宫颈癌患者中HR-HPV表达阳性率较HSIL低，可能是因本次研究早期宫颈癌患者的病例数较少。另一方面，由于少数患者其HR-HPV整合至宿主DNA后，可能会出现其宫颈病变程度的加重而其HR-HPV载量减少的情况；此外，病毒型别的差异可能会引起其病变程度的差异性，尽管其HR-HPV载量较高亦会引起其致癌性的不同，所以，纯粹通过HR-HPV载量的分析方式仍需进一步探索和总结。

3.3P16蛋白、HPV L-1壳蛋白与宫颈癌病变的关系分析

P16基因作为细胞周期蛋白依赖性激酶的抑制因子之一，发挥着负调控细胞周期的作用，其高表达与CIN病变程度存在一定的关联性。HPV L-1壳蛋白作为HR-HPV的结构蛋白之一，同时是诱导宿主免疫能力的重要抗原，亦是HPV疫苗形成的重要前提。已有部分研究指出，P16蛋白引起的宫颈癌存在一定的联系。原因可能是宿主细胞P53与Rb基因失活后，使得P16与CDK4/CDK6结合的途径受限，从而减轻pRb磷酸化作用，使得转录因子E2F得以激活，进而解除P16蛋白的负反馈抑制作用，最终使得其蛋白呈现过高表达[7-8]。当HPV进展到转化阶段时，在HPV L-1壳蛋白表达缺失的情况下，会使得患者宫颈部分免疫反应逐渐降低而引起疾病进一步发展。故此，研究P16蛋白、HPV L-1壳蛋白可利于评估HR-HPV感染的情况。本次研究结果发现，在慢性宫颈炎中，P16蛋白表达阳性率与HR-HPV呈正相关关系；在LSIL中，P16蛋白、HPV L-1壳蛋白阳性表达率与HR-HPV均呈正相关关系；在HSIL及早期宫颈癌中，P16蛋白、HPV L-1壳蛋白阳性表达率与HR-HPV均未存在显著相关性。可见，HR-HPV较高载量的情况下，能够在患者疾病早期迅速刺激其宫颈部分的免疫效应，而可能会引起P16高表达；随着宫颈癌病变程度的提升，P16蛋白、HPV L-1壳蛋白的相关性并不明显；如果各种因素引起机体的免疫效应降低，很有可能会导致疾病发展至早期癌病或癌前病变。

综上所述，各种指标联合后对HPV感染宿主的状态进行综合分析，更有助于评估患者疾病的预后情况。P16蛋白、HPV L-1壳蛋白表达阳性可作为宫颈癌前病变出现的分子事件，两种蛋白在CINⅠ中与病毒载量存在一定的关联性，但在CINⅡ、CINⅢ与宫颈癌组织中往往以低病毒载量为主，所以相比单一选择病毒载量进行检测，P16蛋白、HPV L-1壳蛋白在CINⅠ患者疾病预后的评估作用可能更高。

[1]Ebisch R M, Siebers A G, Bosgraaf R P,etal. Triage of high-risk HPV positive women in cervical cancer screening[J]. Expert Rev Anticancer Ther, 2016,16(10):1073-1085.

[2]Ortega-Cervantes L, Aguilar-Lemarroy A, Rojas-García A E,etal. Human papilloma virus genotypes in women from Nayarit, Mexico, with squamous intraepithelial lesions and cervical cancer[J]. Int J Health Sci (Qassim), 2016,10(3):327-338.

[3]石慧敏, 谭洁. 人乳头瘤病毒检测对宫颈病变患者分流价值[J].中国妇幼健康研究,2012,23(3):339-340,351.

[4]Castle P E, Aslam S, Behrens C. Cervical precancer and cancer risk by human papillomavirus status and cytologic interpretation: implications for risk-based management[J]. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev, 2016,25(12):1595-1599.

[5]Nakayama Y,Yamada M,Kurata A,etal. Evaluation of the human papillomavirus mRNA test for the detection of cervical lesions in Japan[J]. Eur J Gynaecol Oncol,2015,36(2):192-196.

[6]Polman N J, Uijterwaal M H, Witte B I,etal. Good performance of p16/ki-67 dual-stained cytology for surveillance of women treated for high-grade CIN[J].Int J Cancer,2017,140(2):423-430.

[7]方婧, 洪颖. 高危型人乳头瘤病毒核酸检测试剂盒-Care HPV用于宫颈癌及癌前病变筛查的临床价值[J].中国妇幼健康研究,2016,27(4):457-459.

[8]Pirtea L, Grigora D, Matusz P,etal. Age and HPV type as risk factors for HPV persistence after loop excision in patients with high grade cervical lesions: an observational study[J]. BMC Surg, 2016,16(1):70.

[专业责任编辑：安瑞芳]

Expressions of P16 and HPV L-1 capsid protein in CIN and early cervical carcinoma and their screening value for cervical precancerous lesions

XIANG Yuan-yuan, WANG Miao-miao, XIE Yan,YUANG Zhi-min

(Department of Obstetrics and Gynecology, Maternal and Child Health-Care Center Affiliated to Medical College of Yangzhou University, Jiangsu Huaian 226600, China)

Objective To analyze the expression and screening value of P16 protein and human papillomavirus L-1 capsid protein in cervical intraepithelial neoplasia (CIN) and cervical carcinoma. Methods Totally 50 patients with CIN and early cervical carcinoma were selected in department of obstetrics and gynecology from Maternal and Child Health-Care Center in Huaian City, and the expressions of P16 and HPV L-1 protein were detected by using hybrid captureⅡand immunohistochemical staining methods. Results The positive rate of P16 in chronic cervicitis (9.09%), low-grade squamous intraepithelial lesion (LSIL) (52.94%), high-grade squamous intraepithelial lesion (HSIL) (84.21%) and early cervical carcinoma (100.00%) were gradually increased (χ2=45.38,P=0.00), and the positive rate of human papillomavirus L-1 capsid protein was 18.18%, 35.29%, 15.79% and 0.00%, respectively, which also had significant differences (χ2=12.59,P=0.00). With the virus load increasing, the positive rates of P16 and human papillomavirus L-1 protein showed significant differences (χ2value was 41.37 and 32.95, respectively, bothP<0.01). In the cases of chronic cervicitis, the positive rate of P16 was positively correlated with the high-risk human papillomavirus (HR-HPV) (r=0.52,P=0.01). In the cases of LSIL, the positive rates of P16 and human papillomavirus L-1 protein were positively correlated with HR-HPV (rvalue was 0.58 and 0.33, respectively, bothP<0.05). In the cases of HSIL and early cervical carcinoma, the positive rates of P16 and human papillomavirus L-1 protein had no significant correlation with high-risk human papillomavirus (rvalue was 0.12, 0.26 and 0.62, respectively, allP>0.05). Conclusion The positive expressions of P16 and human papillomavirus L-1 caspid protein are molecular events of cervical precancerous lesions, which has high value in the screening of CIN and early cervical carcinoma, so it is worthy of clinical application and promotion.

high-risk human papillomavirus (HR-HPV); P16 protein; human papillomavirus L-1 capsid protein; cervical intraepithelial neoplasia (CIN); cervical carcinoma

2017-03-01

项媛媛(1982-)，女，主治医师，主要从事宫颈疾病临床诊断与治疗工作。

袁智民，主任医师。

10.3969/j.issn.1673-5293.2017.07.009

R711.7

A

1673-5293(2017)07-0778-03