脂氧素A4、肿瘤坏死因子及其比值与子痫前期发生发展的相关性研究

王 莉，丁依玲

(1.海南省人民医院产科，海南 海口 570000；2.中南大学湘雅二院产科，湖南 长沙 410000)

脂氧素A4、肿瘤坏死因子及其比值与子痫前期发生发展的相关性研究

王 莉1，丁依玲2

(1.海南省人民医院产科，海南 海口 570000；2.中南大学湘雅二院产科，湖南 长沙 410000)

目的 探讨脂氧素A4(LXA4)、肿瘤坏死因子(TNF-α)在子痫前期(PE)中的表达及意义。方法 选取2016年2月至2017年2月在海南省人民医院分娩的PE产妇78例，其中轻度PE产妇45例，重度PE产妇33例，同时选取正常产妇50例作为对照组，采用ELISA法检测产妇血清LXA4、TNF-α表达，采用免疫组化法检测胎盘组织LXA4受体和TNF-α表达。结果 轻度PE组和重度PE组胎盘组织中LXA4受体蛋白阳性表达率为55.55%、60.61%，明显低于对照组(χ2值分别为19.077、14.246，均P<0.05)，而TNF-α蛋白阳性表达率为80.00%和81.82%，明显高于对照组(χ2值分别为25.688、23.035，均P<0.05)。轻度PE组血清LXA4为(176.55±43.21)ng/L，明显高于对照组和重度PE组(t值分别为12.163、10.476，均P<0.05)；轻度PE组和重度PE组TNF-α分别为(18.03±1.43)ng/mL和(18.22±2.03)ng/mL，明显高于对照组(t值分别为48.500、37.304，均P<0.05)；重度PE组LXA4/TNF-α为(5.02±1.10)，明显低于对照组和轻度PE组(t值分别为25.271、16.106，均P<0.05)；轻度PE组LXA4/TNF-α为(9.80±1.42)，明显低于对照组(t=16.970，P<0.05)。轻度PE组和重度PE组血清LXA4与TNF-α呈负相关(r值分别为-0.522、-0.413，均P<0.05)；对照组和重度PE组胎盘组织LXA4受体和TNF-α表达呈负相关(rs值分别为-0.344、-0.321，均P<0.05)；LXA4/TNF-α与PE患者病情呈负相关(rs=-0.412，P<0.05)。结论 PE患者血清LXA4、TNF-α及胎盘组织LXA4受体、TNF-α表达异常，可能与疾病的发生发展有关，其中LXA4/TNF-α比值可一定程度反映患者病情程度。

脂氧素A4；肿瘤坏死因子；子痫前期；相关性

子痫前期(preeclampsia，PE)的发生发展，特别是子痫的发生可以导致孕产妇病死率的上升，并促进最终不良临床结局的发生。有流行病学研究显示PE的发病率可达0.6%～1.8%，在部分地区的人群中该病发病率更高[1]。在探讨PE发病机制的过程中发现，细胞炎症因子等生物学因子激活导致的氧化应激障碍或者代谢性损伤等，均可以促进PE患者的病情进展。脂氧素A4(lipoxin A4，LXA4)、肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor ，TNF-α)等，可以通过激活下游炎症因子IL-6等的上调，促进胎盘血管内皮的损伤，加剧胎盘血管的螺旋化等重塑性障碍，导致血流动力学紊乱[2-4]。为了进一步揭示LXA4、TNF-α在PE发病机制过程中的作用，本研究选取2016年2月至2017年2月在海南省人民医院分娩的PE产妇78例，探讨相关指标在胎盘及血清中的异常表达，报道如下。

1资料与方法

1.1一般资料

选取2016年2月至2017年2月在海南省人民医院分娩的PE产妇78例，其中轻度PE产妇45例(轻度PE组)，重度PE产妇33例(重度PE组)。纳入标准：①诊断符合谢幸等主编的《妇产科学》(第8版)标准；②自愿提供胎盘组织；③单胎妊娠初产妇；④产妇及家属知情同意并签署同意书。排除标准：①合并胎膜早破、前置胎盘等产科其他合并症；②有糖尿病、甲状腺功能亢进、血液系统疾病等；③近1个月内服用过抗炎药物或免疫抑制类药物。同时选取正常产妇50例作为对照组。对照组、轻度PE组和重度PE组产妇年龄、孕周、孕次等一般资料比较差异无统计学意义，见表1。

组别例数(n)年龄(岁)孕周(周)孕次(次)对照组5026.03±3.4138.21±2.061.24±0.41轻度PE组4525.94±2.8038.04±1.971.20±0.24重度PE组3326.06±3.0438.17±2.161.31±0.34F1.0672.0441.874P>0.05>0.05>0.05

1.2酶联免疫吸附测定

采集两组患者静脉血用ELISA法检测LXA4、TNF-α水平，采用低温高速离心机进行离心，1000r/min(离心半径为15cm)，获得血清后抽取50μL样品加入96孔板内，采用去离子水作为阴性对照，采用50μL缓冲液作为阳性对照，平衡摇晃20s混匀，室温下孵育2h，采用磷酸盐缓冲液(TBST)清洗3次，每次5min，加入100μL底物，平衡摇晃30～45s，25℃室温下孵育40min，加入250μL终止物，直到96孔板中每孔的颜色变黄，最后以空白对照为基准，采用分光光度计进行读数。LXA4、TNF-α抗体购自罗氏检测公司，相关配套试剂购自南京凯基生物科技有限公司，严格按照说明书的要求进行操作。

1.3免疫组化检测

采用石蜡切片脱蜡至水，切片厚度3mm，3%H2O2室温孵育5min，采用去离子水冲洗3次，每次3min，采用浓度为10%牛奶蛋白(1g蛋白加入100mL纯水)封闭，室温孵育5min，加入LXA4受体和TNF-抗体(鼠来源，南京碧云天生物科技有限公司)，37℃孵育2h，PBS缓冲液冲洗3次，每次5min，滴加辣根过氧化物酶(horseradishperoxidase，HRP)标记的二抗(兔来源，购自罗氏检测公司)，37℃孵育30min，PBS冲洗3次，每次5min，加入溴甲酚紫指示剂，显色5min，复染，脱水，透明，封片，镜下观察。所用Olipics电子显微镜购自上海精密仪器有限公司，配套试剂购自南京泰康生物科技有限公司。

1.4结果判断

采用Fromowitz综合计分法，蛋白阳性表达位于细胞胞浆内，呈棕黄色颗粒。随机选取5个高倍镜视野，计数滋养细胞总数及阳性细胞总数，根据阳性细胞比例计分，比例<25%为1分，25%～50%为2分，51%～75%为3分，>75%为4分；染色强度为无着色为0分，浅黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分；总分=染色强度得分×细胞比例得分，>2分为阳性，≤2分为阴性。

1.5统计学方法

2结果

2.1各组胎盘组织LXA4受体和TNF-α表达

轻度PE组和重度PE组胎盘组织中LXA4受体蛋白阳性表达率为55.55%和60.61%，明显低于对照组(χ2值分别为19.077、14.246，均P<0.05)，而TNF-α蛋白阳性表达率为80.00%和81.82%，明显高于对照组(χ2值分别为25.688、23.035，均P<0.05)，见表2和图1。

表2 各组胎盘组织LXA4受体和TNF-α表达[n(%)]

Table 2 Expressions of LXA4 receptor and TNF-αin placenta[n(%)]

注：a与对照组比较P<0.05。

注：A和D为对照组LXA4受体和TNF-α表达；B和E为轻度PE组LXA4受体和TNF-α表达；C和F为重度PE组LXA4受体和TNF-α表达。

图1 免疫组化图

Fig.1Immunohistochemistryresults

2.2各组血清LXA4、TNF-α比较

轻度PE组血清LXA4明显高于对照组和重度PE组(t值分别为12.163、10.476，均P<0.05)；轻度PE组和重度PE组TNF-α明显高于对照组(t值分别为48.500、37.304，均P<0.05)；重度PE组LXA4/TNF-α明显低于对照组和轻度PE组(t值分别为25.271、16.106，均P<0.05)；轻度PE组LXA4/TNF-α明显低于对照组(t=16.970，P<0.05)，见表3。

2.3相关性分析

轻度PE组和重度PE组血清LXA4与TNF-α呈负相关(r值分别为-0.522、-0.413，均P<0.05)，而对照组血清LXA4与TNF-α无相关性(P>0.05)。对照组和重度PE组胎盘组织LXA4受体和TNF-α表达呈负相关(rs分别为-0.344、-0.321，均P<0.05)，而轻度PE组胎盘组织LXA4受体和TNF-α表达无相关性(P>0.05)；LXA4/TNF-α与PE患者病情呈负相关(rs=-0.412，P<0.05)。

组别例数(n)LXA4(ng/L)TNF-α(ng/mL)LXA4/TNF-α对照组5090.30±24.165.22±1.1417.30±2.64轻度PE组45176.55±43.21ab18.03±1.43a9.80±1.42ab重度PE组3391.43±20.4418.22±2.03a5.02±1.10aF43.16420.04424.107P<0.05<0.05<0.05

注：a与对照组比较P<0.05；b与重度PE组比较P<0.05。

3讨论

3.1子痫前期的背景相关研究

饮食习惯的改变、遗传易感因素及高脂血症等，均可以促进子痫前期的发生发展，特别是在具有高血压家族史的患者中，子痫前期的发病率可较普通对照人群上升3～4倍[5]。子痫前期的长期发展，可以导致孕产妇妊娠中晚期发生胎盘早剥、产后出血及产褥期并发症的发生，临床预后不佳。解痉、降压、肝素抗凝等综合性治疗，虽然可以在一定程度上抑制病情的进展，但治疗的总有效率不足35%，患者的病情进展率仍然可达40%以上。而对于子痫前期发病过程中的相关机制的探讨，可以为疾病的生物学治疗提供理论基础，从而提高子痫前期的治疗效果。

3.2LXA4及TNF-α的异常表达与PE发病的潜在关系

LXA4可以通过增加胎盘血管内皮细胞的氧化损伤，促进绒毛膜滋养细胞凋亡和蜕膜组织的退行性病变，进而导致子痫前期的发生发展。特别是对于胎盘血管的螺旋化、弓状血管的重塑等生理过程的影响，可以导致胎盘血管的血流灌注阻力的增加，促进病情的进展[6-7]。TNF-α作为细胞炎症因子，其可以通过激活下游单核细胞、巨噬细胞等的上调，促进炎症细胞对于胎盘组织的浸润[8]，加剧了胎盘血管的螺旋化病理改变、促进血流动力学障碍，血流呈现明显的高阻力、低灌注表现，从而影响血压波动[9-10]。已有研究探讨了LXA4及TNF-α的异常表达，但多数研究局限于血清学资料的对比研究，缺乏对胎盘组织中相关蛋白水平的表达研究。

3.3LXA4及TNF-α的异常表达在促进PE患者病情进展过程中的作用

本研究发现，在胎盘组织中，LXA4受体的阳性表达水平较低，低于正常对照组人群，差异具有统计学意义，提示LXA4受体的异常表达可能促进了子痫前期患者的病情进展，LXA4受体数量或者敏感性的改变，可以通过影响胎盘组织的氧化应激障碍、促进炎症反应等，进而导致血压的波动，促进肾脏等多器官的损伤；在胎盘组织中，可发现TNF-α蛋白的阳性表达率较高，高于正常对照人群，TNF-α的高表达可以通过激活下游IL-6者IL-10等，加剧局部线粒体能量利用障碍，促进胎盘微血管的损伤。王素梅等[11]和张俊农[12]在探讨重度子痫前期患者的发病机制的过程中发现，TNF-α等的激活是促进PE患者病情进展的持续性核心因素，其中胎盘组织中TNF-α的表达阳性率可平均上升25%以上，患者的血压控制效果越差、病情越严重，相关指标的表达越高。在探讨血清学相关指标的改变过程中发现，轻度PE组和重度PE组TNF-α明显高于对照组，TNF-α在胎盘组织或者血清中均呈现出明显的高表达趋势[12]，但本研究并未发现LXA4在血清中表现出同样的低表达趋势，结果显示轻度PE组血清LXA4明显高于对照组和重度PE组，差异具有统计学意义，考虑可能与LXA4的受体敏感性或正反馈调控障碍等有关，也可能与本研究的样本量总量的不足有关。LXA4/TNF-α可以有效评估患者的病情，重度组患者的LXA4/TNF-α明显低于轻度组，而轻度组LXA4/TNF-α也明显低于对照组。相关关系分析也发现，LXA4与TNF-α具有密切的关系，同时LXA4/TNF-α与PE患者病情呈负相关，患者的病情越严重，LXA4/TNF-α的指标越低。

3.4总结

本研究的创新性在于探讨了LXA4受体水平的表达异常，同时揭示了胎盘组织中LXA4等因子的表达变化，相关关系分析也可以进一步揭示不同炎症因子的致病机制。综上所述，PE患者血清LXA4和TNF-α，以及胎盘组织中LXA4受体和TNF-α表达异常，可能与子痫前期的发生发展有关，其中LXA4/TNF-α比值可在一定程度上反映病情程度。

[1]Alanbay I,Coksuer H,Ercan C M,etal.Chitotriosidase, interleukin-1 beta and tumor necrosis factor alpha levels in mild preeclampsia[J].Arch Gynecol Obstet,2012,285(6):1505-1511.

[2]Naderi M,Yaghootkar H,Tara F,etal.Tumor necrosis factor-alpha polymorphism at position -238 in preeclampsia[J].Iran Red Crescent Med J,2014,16(1):e11195.

[3]Lau S Y,Guild S J,Barrett C J,etal.Tumor necrosis factor-alpha, interleukin-6, and interleukin-10 levels are altered in preeclampsia: a systematic review and meta-analysis[J].Am J Reprod Immunol,2013,70(5):412-427.

[4]Gomaa M F,Naguib A H,Swedan K H,etal.Serum tumor necrosis factor-α level and uterine artery Doppler indices at 11-13 weeks’ gestation for preeclampsia screening in low-risk pregnancies: a prospective observational study[J].J Reprod Immunol,2015,109:31-35.

[5]Perucci L O,Gomes K B,Freitas L G,etal.Soluble endoglin, transforming growth factor-beta 1 and soluble tumor necrosis factor alpha receptors in different clinical manifestations of preeclampsia[J].PLoS One,2014,9(5):e97632.

[6]董微,辛力,匡德凤.脂氧素A4、肿瘤坏死因子α与子痫前期的关系研究[J].实用妇产科杂志,2016,32(2):117-122.

[7]苏莎,唐卉,王素梅,等.ALX-R、5-LOX及IL-1β在子痫前期胎盘组织中的表达及其意义[J].广西医学,2013,35(11):1454-1457.

[8]杨扬,高建华,孙敬霞,等.肿瘤坏死因子α与子痫前期的关系[J].现代生物医学进展,2015,15(13):2558-2561.

[9]刘金林,孔丽娜.炎症因子在子痫前期发病中的作用研究进展[J].承德医学院学报,2016,33(4):327-330.

[10]明芳,杨洁,吕秀芳.脂联素与肿瘤坏死因子-α在子痫前期发病患者胎盘组织中的表达水平及意义[J].中国当代医药,2016,23(13):98-100.

[11]王素梅,苏莎,唐卉.脂氧素与子痫前期发病机制的研究进展[J].广西医科大学学报,2013,30(2):317-319.

[12]张俊农,贺鹤,董微.脂氧素对子痫前期大鼠治疗的研究[J].天津医药,2013,41(3):238-240.

[专业责任编辑：马良坤]

Relationship between LXA4, TNF- and LXA4/TNF- and development of PE

WANG Li1, DING Yi-ling2

(1.Department of Obstetrics and Gynecology, Hainan Provincial People's Hospital, Hainan Haikou 570000, China; 2. Department of Obstetrics, The Second Xiangya Hospital of Central South University, Hunan Changsha 410000, China)

Objective To investigate the expression and significance of lipoxin A4 (LXA4) and tumor necrosis factor (TNF-) in preeclampsia (PE). Methods Totally 78 cases of PE delivering in Hainan Provincial People's Hospital during the period of February 2016 to February 2017 were selected, including 45 cases of mild PE (mild PE group) and 33 cases of severe PE (severe PE group). And 50 normal pregnant women were selected as control group. The expression of serum LXA4 and TNF- were detected by ELISA method, and immunohistochemistry was used to detect the placenta LXA4 receptor and TNF- expression.Results The positive expression rate of placenta LXA4 receptor in mild PE group and severe PE group was 55.55% and 60.61%, respectively, which was significantly lower than in the control group (χ2value was 19.077 and 14.246，respectively, bothP<0.05), while the positive expression rate of TNF- protein was 80.00% and 81.82%, respectively, which was significantly higher than in the control group (χ2value was 25.688 and 23.035，respectively, bothP<0.05). In mild PE group serum LXA4 was 176.55±43.21ng/L, which was significantly higher than in the control group and severe PE group (tvalue was 12.163 and 10.476，respectively, bothP<0.05). In mild PE group and severe PE group TNF- was 18.03±1.43ng/mL and 18.22±2.03ng/mL, which was significantly higher than in the control group (tvalue was 48.500 and 37.304，respectively, bothP<0.05). LXA4/TNF- in severe PE group was 5.02±1.10, and it was significantly lower than in the control group and mild PE group (tvalue was 25.271 and 16.106, respectively, bothP<0.05), while that in mild PE group was 9.80±1.42 and it was significantly lower than in the control group (t=16.970，P<0.05). In mild PE group and severe PE group serum LXA4 and TNF- were negatively correlated (rvalue was -0.522 and -0.413, respectively, bothP<0.05). Placenta LXA4 receptor was negatively correlated with TNF- in the control group and severe PE group (rsvalue was -0.344 and -0.321, respectively, bothP<0.05). LXA4/TNF-a was negatively correlated with PE patient condition (rs=-0.412,P<0.05). Conclusion The expressions of serum LXA4 and TNF- and placenta LXA4 receptor and TNF- of PE patients are abnormal, and they may be related to the occurrence and development of disease, in which LXA4/TNF- can reflect the degree of disease to some extent.

lipoxin A4 (LXA4); tumor necrosis factor (TNF-); preeclampsia (PE); correlation

2017-04-11

王 莉(1978-)，女，副主任医师，硕士研究生，主要从事高危妊娠的研究。

丁依玲，主任医师。

10.3969/j.issn.1673-5293.2017.07.006

R714.2

A

1673-5293(2017)07-0768-03