TERT修饰骨髓间充质干细胞移植促进TBI大鼠自噬及认知功能的作用及机制

杨烽

[摘要]目的 研究端粒酶逆转录酶（TERT）基因修饰的骨髓间充质干细胞（BMSCs）促进脑创伤（TBI）大鼠脑组织自噬及认知功能的作用，探讨可能的分子机制。方法 分离并鉴定大鼠BMSCs，应用pLXSN-TERT病毒重组子转染BMSCs。应用Marmarou方法制备脑创伤TBI大鼠模型。将64只大鼠随机分为四组，分别为TBI组、BMSCs-TBI组和TERT-BMSCs-TBI组和对照组，每组各16只。应用HE染色光镜观察大鼠脑组织结构及病理改变。Western blot检测BDNF、NGF等神经生长因子的蛋白表达水平；检测自噬相关因子Beclin1和Parkin的蛋白表达水平。应用Morris水迷宫方法检测大鼠学习记忆认知功能的改变。结果 在Morris水迷宫检测大鼠定位航行试验中，与对照组比较，TBI组平均逃避潜伏期延长（P<0.05）；与TBI组比较，TERT-BMSCs-TBI组、BMSCs-TBI组平均逃避潜伏期缩短（P<0.05）。在空间探索试验中，TBI组大鼠在原平台象限的停留时间明显较对照组大鼠缩短；而TERT-BMSCs-TBI组、BMSCs-TBI组与TBI组比较，在原平台象限的停留时间明显延长（P<0.05）。Western blot检测发现，与TBI组比较，BMSCs-TBI组、TERT-BMSCs-TBI组脑皮层组织中BDNF、NGF、Beclin1、Parkin蛋白表达水平均升高（P<0.05）；与BMSCs-TBI组比较，TERT-BMSCs-TBI组显著升高（P<0.05）。结论 TERT修飾的BMSCs较普通BMSCs移植TBI大鼠学习记忆认知功能恢复更显著，其分子机制可能与增强自噬功能有关。

[关键词]脑创伤；端粒酶；骨髓间充质干细胞；自噬；认知功能

[中图分类号] R651.15 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2017）07（c）-0104-04

Effects and mechanisms of TERT modified bone marrow mesenchymal stem cells transplantation on autophagy and cognitive function in TBI rats

YANG Feng

Department of Neurosurgery，the Sixth People′s Hospital of Chongqing，Chongqing 400060，China

[Abstract]Objective To investigate the effects of bone marrow mesenchymal stem cells （BMSCs） under modification of telomerase reverse transcriptase （TERT） gene in improving brain tissue autophagy and cognitive function of rats with traumatic brain injury （TBI），as well as to investigate possible molecular mechanisms.Methods BMCSs of rats was separated and authenticated，pLXSN-TERT virus recombinants were applied to carry out transfection of BMSCs，Marmarou method was adopted to prepare the models of rats with TBI. 64 rats were randomly divided into four groups，namely TBI group，BMSCs-TBI group，TERT-BMSCs-TBI group and the control group，with 16 rats in each group.HE light microscopy was used to observe the brain tissue structure of rats and pathologic change.The protein expression levels of BDNF，NGF and other nerve growth factors were detected with Western blot；as well as the protein expression levels of Beclin1 and Parkin relevant to autophagy were detected correspondingly.Then Morris （Morris Water Maze） was applied to detect the change on learning and memorizing cognitive function of rats.Results Among Morris detecting place navigation test of rats，the mean escape latency of TBI group prolongs compared to the control group （P<0.05）.Compared to TBI group，the TERT-BMSCs-TBI group and BMSCs-TBI group take less mean escape latency （P<0.05）.In the space probe trial，the duration of stay of TBI group in original platform quadrant was obviously less than the control group；the duration of stay of TERT-BMSCs-TBI group and BMSCs-TBI group significantly prolong compared to TBI group （P<0.05）.Through Western blot detection，the result indicated that expression of protein of BDNF，NGF，Beclin1，Parkin in brain mantle tissue increased obviously in TERT-BMSCs-TBI group and BMSCs-TBI group compared to TBI group （P<0.05），and significantly increased in group TERT-BMSCs-TBI compared with BMSCs-TBI group （P<0.05）.Conclusion Compared to general BMSCs transplant，the rats with BMSCs under modification of TERT have more significant learning and memorizing cognitive recovery function，that the molecular mechanism may be related to autophagy function enhancement.

[Key words]Traumatic brain injury；Telomerase；Bone marrow mesenchymal stem cells；Autophagy；Cognitive function

腦创伤（traumatic brain injury，TBI）是神经外科较为常见的一种多发病，死亡率和伤残率居严重创伤之首[1]。降低TBI的死亡率、致残率以及提高患者的预后一直是神经外科领域研究的重点和难点[2]。骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）是干细胞的一种，可诱导内源性干细胞增殖，促进脑组织再生以及神经功能恢复[3-4]。细胞自噬是细胞内极为有效的清除机制，中枢及外周组织内细胞自噬可以增加细胞代谢水平，有助于代谢废物的清除，维持细胞内蛋白质质量的相对稳定[5-6]。本研究应用Marmarou方法制备TBI大鼠模型，应用端粒酶逆转录酶TERT基因修饰的骨髓间充质干细胞移植到脑创伤大鼠后，观察BDNF、NGF、自噬相关因子Beclin1和Parkin的蛋白表达水平，应用Morris水迷宫方法检测TBI大鼠学习记忆认知功能，探讨端粒酶增加的BMSCs对TBI大鼠的恢复治疗作用与自噬功能的相关性。

1材料与方法

1.1实验对象与仪器

1.1.1 BMSCs 孵育条件：无菌；混合细胞取得方法：L-DMEM培养基（北京天根生化有限公司）（含10% FBS）反复冲洗大鼠股骨、胫骨骨髓腔取得混合细胞。换液频率：每3天换1次。传代比率为1∶2。传代条件：细胞融合率为85%。

1.1.2 TERT修饰BMSCs及细胞克隆实验 构建反转录病毒载体重组子pLXSN-TERT[7]。应用转染试剂Lipofectamine 2000（北京沃比森科技有限公司）转染重组子pLXSN-TERT至BMSCs，用G418于48 h后筛选TERT-BMSCs继续培养，2个月后检测TERT mRNA的表达和端粒酶活性，取对数生长期细胞与低熔点琼脂糖混合后接种，孵育4～6周后计数细胞克隆个数。C6胶质瘤细胞为阳性对照。

1.1.3动物模型 将64只健康的雄性Wistar大鼠（购自中国医学科学院动物实验室）作为动物模型对象，随机分为TBI组、BMSCs-TBI组、TERT-BMSCs-TBI组和对照组，每组各16只，四组大鼠每只体重约400 g。应用Marmarou方法制备TBI大鼠模型（具体方法：用重量450 g、直径18 mm的铜棒，垂直从1.2 m自由下落，撞击在大鼠冠状缝与矢状缝正中钢垫上，造成大鼠中度弥漫性TBI）。造模成功后24 h分别经鼠尾静脉注射移植1 ml体积的PBS、BMSCs（3×106/ml）、TERT-BMSCs（3×106/ml）。移植后7～9 d统计大鼠的存活量，然后将这些大鼠进行Morris水迷宫实验。

1.2检测方法

1.2.1 Morris水迷宫实验 水迷宫实验分析装置购自上海欣软信息科技有限公司，包括定位航行实验和空间探索实验，前者是记录逃避潜伏期，后者是记录在原平台象限游泳时间[8]。大鼠经水迷宫测试后行心脏灌注4%多聚甲醛（上海翊圣生物科技有限公司）取脑，继续置入4%多聚甲醛中固定，在乳头体和视交叉处垂直切断脑组织，常规酒精梯度脱水、石蜡包埋、切片。HE染色，封固。光镜下观察并拍片。

1.2.2大鼠脑皮层组织Western blot蛋白印迹法检测BDNF、NGF、Beclin1、Parkin蛋白表达水平 大鼠经水迷宫测试后断头处死，取脑，分离脑皮层组织，猝冷，取50 mg脑皮层组织，裂解、离心、取上清液，Bradford法测定蛋白浓度，上样、变性，取样品50 μg行蛋白电泳，将蛋白印记转移到PVDF膜上，5%脱脂奶粉封闭，加入一抗4℃过夜，洗膜后加入二抗，孵育，膜清洗后显色、显影。灰度扫描。

1.3评估指标

BMSCs表面标志物的鉴定；BMSCs转染TERT后端粒酶活性的鉴定：细胞克隆形成实验检测；大鼠学习记忆能力测试结果；大鼠脑皮层HE染色、光镜下观察结果；大鼠脑皮层组织BDNF、NGF、Beclin1、Parkin蛋白表达水平。

1.4统计学方法

采用SPSS 13.0统计学软件进行数据分析，计量资料数据用均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用Student′s t检验；以P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1 BMSCs表面标志物的鉴定

CD90、CD44和CD29标记阳性，CD45、CD34和CD31标记阴性。

2.2细胞克隆形成实验检测结果

BMSCs-TBI组、TERT-BMSCs-TBI组均没有细胞克隆形成，并且移植到大鼠后，大鼠均无死亡，24周后未见肿瘤形成。而C6胶质瘤细胞有大量细胞克隆，移植到大鼠体内具有相对安全性。

2.3大鼠学习记忆能力测试结果

在Morris水迷宫检测大鼠定位航行试验中，TBI组与对照组比较，平均逃避潜伏期延长（P<0.05）。TERT-BMSCs-TBI组、BMSCs-TBI组与TBI组比较，平均逃避潜伏期缩短（P<0.05）。在空间探索试验中，TBI组大鼠在原平台象限的停留时间明显较对照组大鼠缩短；而TERT-BMSCs-TBI组、BMSCs-TBI组与TBI组比较，在原平台象限的停留时间明显延长（P<0.05）。结果提示，移植BMSCs后大鼠学习记忆能力显著改善，而移植转染TERT的BMSCs后，其改善更为明显（图1）。

*P<0.05

图1 各组大鼠水迷宫试验结果的比较

2.4大鼠脑皮层的HE染色、光镜下观察结果

對照组大鼠脑皮层神经细胞结构基本完整，核仁核膜清晰可见，核仁染色均匀，核膜完整，胞质染色呈均匀红色。TBI组大鼠脑皮层见脑组织水肿，毛细血管扩张，神经细胞有变形坏死改变，胞核可见空泡化及核体皱缩，胞浆气球样变及淡染。BMSCs-TBI组、TERT-BMSCs-TBI组与TBI组比较染色均有减轻，TERT-BMSCs-TBI组与BMSCs-TBI组比较染色减轻更显著。

2.5大鼠脑皮层组织Beclin1、Parkin、BDNF、NGF蛋白表达水平分析

Western blot方法检测发现，BMSCs-TBI组、TERT-BMSCs-TBI组脑皮层组织Beclin1、Parkin、BDNF、NGF蛋白表达与TBI组比较均明显升高（P<0.05），TERT-BMSCs-TBI组比BMSCs-TBI组显著增加（P<0.05）（图2）。

*P<0.05

图2 各组大鼠脑组织Beclin1、Parkin、BDNF、NGF蛋白表达水平的比较

3讨论

脑损伤后为了维持身细胞自身的稳定会发生自噬，发生自噬时可以将已经损坏的细胞器通过溶媒途径讲解，从而达到能量与蛋白的再循环[9]。Beclin1是自噬的调控基因[10]，是酵母自噬基因ATG6的同源物，也是哺乳动物参与自噬的特异性基因，主要调控自噬体的形成与成熟[11]。线粒体自噬是自噬的一种，在脑组织中PINK1/Parkin信号通路参与了细胞内线粒体自噬过程，在清除受损线粒体过程中发挥了重要作用[12]。Parkin分子定位到线粒体外膜对外膜蛋白进行泛素化修饰，介导受损线粒体被自噬体包裹而降解[13-14]。本研究结果发现，TBI组大鼠经BMSCs、TERT-BMSCs移植后，Beclin1、Parkin的表达和大鼠学习记忆能力显著增强，其中TERT-BMSCs移植后增强更为显著。

BMSCs是目前治疗脑损伤的一个新的研究方向，BMSCs可以在体内外诱导下分泌BDNF、NGF，还可以向神经元方向诱导转化，BDNF、NGF抵御神经细胞损伤，保护神经细胞，促进神经细胞的分化和再生，本身还可向神经细胞转化，对损伤脑组织起修复作用。但BMSCs生存周期短，在移植后对损伤脑组织的修复作用受限[15-16]。本研究通过构建反转录病毒载体重组子pLXSN-TERT，获得TERT调控的BMSCs，避免细胞过度衰老，稳定其在体内外的生长。研究结果提示，TBI组大鼠经BMSCs、TERT-BMSCs移植后，BDNF、NGF的表达显著增强，其中TERT-BMSCs移植后表达增强更为显著。光镜下观察到，BMSCs-TBI组、TERT-BMSCs-TBI组与TBI组比较，脑细胞损伤均有减轻，TERT-BMSCs-TBI组与BMSCs-TBI组比较减轻更为显著。

综上所述，TERT-BMSCs移植对TBI有明显的治疗作用，促进脑损伤后脑功能的重塑，促进学习记忆能力的增强。但对TBI康复治疗作用的具体机制是怎样的还有待进一步研究。

[参考文献]

[1]Drayna PC，Abramo TJ，Estrada C.Near-infrared spectroscopy in the critical setting[J].Pediatr Emerg Care，2011，279（5）：432-439.

[2]Lim ST，Esfahani K，Avdoshina V，et al.Exogenous gangliosides gengliosides increase the release of brain-derived neurotrophic factor[J].Neuropharmacology，2011，60（7-8）：1160-1167.

[3]Cummings DM，Belluscio L.Continuous neural plasticity in the olfactory intrabulbar circuitry[J].J Neurosci，2010，30（27）：9172-9180.

[4]Liu YJ，Wang Q，Li B.Neuronal responses to looming objects in the superior colliculus of the cat[J].Brain Behav Evol，2011， 77（3）：193-205.

[5]Smuder AJ，Kavazis AN，Min K，et al.Exercise protects against doxorubicin-induce markers of autophagy signaling in skeletal muscle[J].J Appl Physiol（1985），2011，111（4）：1190-1198.

[6]He C，Sumpter RJ，Levine B.Exercise induces autophagy in peripheral tissues and in the brain[J].Autophagy，2012，8（10）：1548-1551.

[7]Bokara KK，Kwon KH，Nho Y，et al.Retroviral expression of arginine decarboxylase attenuates oxidative burden in mouse cortical neural stem cells[J].Stem Cells Dev，2011，20（3）：527-537.

[8]Morris R.Development of a water-maze procedure for studying spatial learning in the rat[J].J Neurosci Methods，1984， 11（1）：47-60.

[9]Liu K，Sun Y，Gu Z，et al.Mitophagy in ischaemia/reperfusion induced cerebral injury[J].Neurochem Res，2013，38（7）：1925-1300.

[10]Edinger AL，Thompson CB.Defective autophagy leads to cancer[J].Cancer Cell，2003，4（6）：422-424.

[11]McKnight NC，Zhenyu Y.Beclin 1，an essential component and master regulator of PI3K-Ⅲ in health and disease[J].Currpathobiol Rep，2013，1（4）：231-238.

[12]Hattori N，Saiki S，Imai Y.Regulation by mitophagy[J].Int J Biochem Cell Biol，2014，53：147-150.

[13]Zhang CW，Hang L，Yao TP，et al.Parkin regulation and neurodegenerative disorders[J].Front Aging Neurosci，2016， 7：248.

[14]Hamacher-Brady A，Brady NR.Mitophagy programs：mechanisms and physiological implications of mitochondrial targeting by autophagy[J].Cell Mol Life Sci，2016，73（4）：775-795.

[15]Polak SJ，Levengood SK，Wheeler MB，et al.Analysis of the roles of microporosity and BMP-2 on multiple measures of bone regeneration and healing in calcium phosphate scaffolds[J].Acta Biomater，2011，7（4）：1760-1771.

[16]Becker C.Nursing care of the brain injury patient on a locked neurobehavioral unit[J].Rehabil Nurs，2012，37（4）：171-175.

（收稿日期：2017-06-15 本文編辑：任 念）