兔骨髓基质干细胞的培养与鉴定体系的建立

邓辰红++王飞++王文兰

[摘要] 目的 探讨兔骨髓基质干细胞的培养与鉴定体系的建立方法与效果。 方法 空气栓塞的方式处死SPF级新西兰大白兔6只，分离骨髓组织，利用贴壁培养分离纯化兔骨髓基质干细胞，多次传代后以流式细胞术检测细胞表面抗原；以BrdU标记骨髓基质干细胞，将骨髓基质干细胞注入兔颅内，分别于注射1、3周后取脑组织制作石蜡切片，进行免疫荧光染色。 结果 通过贴壁法培養幼年兔骨髓细胞可获得较纯化的骨髓基质干细胞。免疫细胞化学染色显示骨髓基质干细胞中CD44+细胞率超过90%，细胞核未着色；流式细胞仪测定培养骨髓基质干细胞的CD90+细胞率为94.5%，CD34+细胞率为0.24%。BrdU标记显示得到了能够掺DNA合成期的骨髓基质干细胞，标记细胞所占的比例在40.0%以上。 结论 通过贴壁法培养幼年兔骨髓细胞呈多角短梭形，可获得骨髓基质干细胞，BrdU可作为体内示踪骨髓基质干细胞的标志物之一。

[关键词] 骨髓基质干细胞；培养与鉴定体系；BrdU；免疫组化；流式细胞仪

[中图分类号] R329 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2017）07（b）-0020-03

Culture and identification of rabbit bone marrow stromal stem cells

DENG Chenhong1 WANG Fei2 WANG Wenlan1

1.Department of Pediatrics， Inner Mongolia People's Hospital， Inner Mongolia Autonomous Region， Huhhot 010017， China； 2.Department of Orthopaedics， Inner Mongolia People's Hospital， Inner Mongolia Autonomous Region， Huhhot 010017， China

[Abstract] Objective To investigate the methods and effects of the establishment and identification of rabbit bone marrow stromal stem cells. Methods 6 New Zealand rabbits of SPF grade were selected and sacrificed， and the bilateral femoral bone were separated and the bone marrow was given to aspiration， the rabbit bone marrow stromal stem cells were separated and purified by adherent culture method， after several passages， the cell surface antigen was detected by flow cytometry. And the BrdU was used to label bone marrow stromal stem cells. And the bone marrow stromal stem cells were injected into the rabbit brain，1 and 3 weeks after the brain for paraffin sections and immunofluorescence staining. Results The purified bone marrow stromal cells could be obtained by adherent culture method. Immunocytochemical staining showed that the CD44+ cell rate in bone marrow stromal stem cells was over 90%， and the nuclei were not stained. The CD90+ cell rate and CD34+ cell rate in cultured bone marrow stromal cells by flow cytometry were 94.5% and 0.24%. BrdU markers showed that bone marrow stromal cells could be synthesized into DNA， and the percentage of labeled cells was above 40%. Conclusion The cultured rabbit bone marrow cells are polygonal， juvenile short spindle， it can obtain purified bone marrow stromal stem cells， BrdU can be used as one of the ideal markers of bone marrow stromal stem cells in vivo.

[Key words] Bone marrow stromal cells； Culture and identification system； BrdU； Immunohistochemistry； Flow cytometry

随着医学技术的发展，骨组织工程技术在修复骨缺损中的研究越来越深入，其中种子细胞主要来源于骨、骨外膜、骨髓、骨外组织等[1-2]。其中骨髓基质细胞在体内和体外均能成骨，而骨髓基质干细胞是指存在于骨髓基质中的非造血干细胞，其具有多分化潜能，在一定的条件下可以转化成血管内皮细胞、软骨细胞、肌肉细胞、纤维系细胞、脂肪细胞、成骨系细胞等[3-5]。并且骨髓基质干细胞取材方便，体外培养体系比较方便，能在较短时间内得到数量较多并易定向分化为成骨细胞，生物毒性低，当前应用越来越广泛[6-7]。如何有效地分离骨髓基质干细胞是建立诱导骨髓基质细胞向成骨细胞转化的基础[8]。BrdU是一种胸腺嘧啶核苷类似物，它也能够在细胞增殖时期代替胸腺嘧啶渗入正在复制的DNA分子，从而BrdU检测能够反应细胞的生长、增殖状态[9]。其在基础实验中的应用也具有安全、敏感性好、简单、快速等优势；特别是在免疫细胞化学技术中，BrdU可产生一种对比度高的标记，应用更加方便[10]。本文具体探讨了基于BrdU染色的兔骨髓基质干细胞的培养与鉴定体系的建立方法与效果。现报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物及试剂

选择SPF级新西兰大白兔12只[2月龄，体重2～2.5 kg，内蒙古自治区人民医院（以下简称“我院”）动物饲养中心提供，标准饲养，动物合格证号为XP2001332]，实验动物的取得及手术方式通过我院伦理委员会批准。

胎牛低血清培养基DMEM、IMDM来自Sigma公司，青霉素与链霉素来源于上海新华治药厂（批号：201221，2012213），氯丙嗪为市售产品，NaCl等生化分析试剂为分析纯。

1.2 研究方法

1.2.1 原代兔骨髓基质干细胞的取材及分离培养

将6只新西兰大白兔采用空气栓塞的方式处死，消毒后取出两侧的股骨，选择肝素生理盐水进行冲洗，将冲出的骨髓细胞加入至容量为200 mL的专用IMDM培养液中，1500 r/min离心10 min，在沉淀物中加入IMDM培养液混匀继续进行培养，37℃继续培养，培养2 d后更换一半培养液，以后每隔2 d更换一半的培养液，等到7～8 d后进行传代培养。

1.2.2 骨髓基质干细胞特性观察与鉴定

选择处于对数生长期的骨髓基质干细胞制作细胞爬片，运用多聚甲醛固定后进行CD44免疫细胞化学鉴定分析。每张切片随机选取5个高倍视野进行结果判定，按染色强度计分：未着色（0分），淡黄（1分），棕黄（2分），棕褐（3分）。按着色细胞数占同类细胞总数计分：阳性细胞数≤5%（0分），6%～25%（1分），26%～50%（2分），≥51%（3分）；根据两项积分之和判定其结果，<3分为阴性（-），≥3分为阳性（+），≥4分为弱阳性（++），≥6分为强阳性（+++）。

然后将培养的细胞进行表面CD44、CD71、CD90表达情况检查，并进行流式细胞仪测定。

1.2.3 标记骨髓基质干细胞的体内研究

在6只实验兔颅内注射经过BrdU标记的骨髓基质干细胞，注射1周和3周后分别处死3只，在穿刺点选择样本制作石蜡切片，进行免疫荧光染色，选择同一个组织切片随机选择6个不同的视野，阳性率=视野下阳性细胞数/视野下细胞总数×100%。

1.3 统计方法

选择SPSS 20.00软件进行分析，计数资料数据采用百分比表示，计量资料数据选择均数±标准差（x±s）表示，以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 骨髓基质干细胞培养结果

分离的兔原代细胞于培养箱内孵育4 h后细胞基本呈小球形，继续培养5 d后可以发现贴壁的纺锤细胞数量增加，并且呈成簇分布，培养10 d后细胞成片生长；传代培养3 d后增殖迅速（图1，封三）；继续传代培养增殖速度进一步加快，细胞连接紧密，长梭形，出现漂浮的死细胞（图2，封三）。

2.2 骨髓基质干细胞的鉴定

将第二代髓核细胞爬片后，用Anti-CD44进行免疫细胞化学染色，髓核细胞胞浆呈棕黄色阳性反应，CD44+细胞率超过90%，细胞核未着色（图3，封三）。

流式细胞仪测定培养骨髓基质干细胞的CD90+细胞率为94.5%，CD34+细胞率为0.24%，表明本实验培养的细胞为骨髓基质干细胞（图4）。

2.3 骨髓基质干细胞体内外标记效果

BrdU标记的骨髓基质干细胞注射幼兔颅内后，在免疫组化中选择相同的组织片中6个视野不同进行观察，标记细胞所占的比例在40.0%以上（图5，封三）。

3 讨论

骨髓基质细胞为一种不具有造血功能的细胞，具有容易取材、多向分化、体外扩增等多种优点，当前在基础研究与临床上应用比较多见[11]。骨髓基质干细胞是一类具有多向分化潜能的干细胞，在外在因素的刺激下可以进一步向成软骨、成骨、脂肪以及纤维细胞系等[12]。现代研究表明骨髓基质干细胞可与造血干细胞直接反应，并通过分泌生长因子，调节造血干细胞的分化，支持和维持造血微环境[13-14]。

分离和纯化骨髓基质干细胞的基本原则为细胞的黏附性，主要方法为梯度离心法来获得干细胞等[15]。本研究通过贴壁法培养幼年兔骨髓细胞可获得较纯化的细胞，并能在体外长期培养。免疫排斥反应是骨髓基质干细胞移植所面临的主要问题[16]。在鉴定兔骨髓基质干细胞中，髓基质干细胞的表面抗原具有非专一性，CD29、CD44、CD105、CD166等是骨髓基質干细胞的重要标志物[17]。体内实验证明骨髓基质干细胞能在异体内存活时间较长及有着免疫抑制效果，同时有多器官归巢能力[18]。本研究显示免疫细胞化学染色显示CD44+细胞率超过90%，细胞核未着色；流式细胞仪测定培养骨髓基质干细胞的CD90+细胞率为94.5%，CD34+细胞率为0.24%，说明本试验所培养的细胞为骨髓基质干细胞。

随着荧光基因与示踪标记技术的不断完善和成熟，为骨髓基质干细胞的临床应用打下很好的基础[19]。比如绿色荧光蛋白能够完整监测示踪完整活细胞生命现象，能够观察外源性成骨细胞植入体内后的转归与功能[20-21]。BrdU可掺入DNA合成期的骨髓基质干细胞，无需DNA变性即可有效检测，在细胞内很容易扩散，能在细胞和组织水平能更准确地反映细胞增殖等现，也可有效避免样品损伤[22]。

总之，通过贴壁法培养幼年兔骨髓细胞呈多角短梭形，可获得骨髓基质干细胞，BrdU可作为体内示踪骨髓基质干细胞的标志物之一。

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（收稿日期：2017-04-11 本文编辑：李岳泽）