CYP2C9基因多态性在房颤患者华法林抗凝治疗中的意义

吕游++杨杰孚

[摘要] 目的 研究汉族人群CYP2C9基因多态性对房颤患者华法林抗凝治疗的意义，探讨华法林用药个体差异显著的原因。 方法 对北京医院住院治疗的符合研究入选标准的100例应用华法林抗凝治疗的房颤患者提取静脉血DNA，并用聚合酶链反应分别从基因组DNA中特异性扩增CYP2C9基因的第3号外显子及第7号外显子，对DNA产物测序分析，计算其基因型和等位基因频率，同时记录患者基本信息、服药期间的华法林用药剂量及凝血功能。 结果 100例因房颤应用华法林抗凝治疗患者中共筛选到两种等位基因：CYP2C9*1和CYP2C9*3，等位基因频率分别为96%和4%。同时，CYP2C9基因多态性共检测到两种基因型，以CYP2C9*1/*1基因型常见，基因型频率为92%；其次为CYP2C9*1/*3型，基因型频率为8%。在达到抗凝指标（国际标准化比值INR 2.0～3.0）后，CYP2C9*1/*3突变型患者的华法林维持剂量为（2.14±0.55）mg，低于CYP2C9*1/*1野生型组的平均剂量[（3.17±0.74）mg]，两组间剂量差异有统计学意义（P < 0.05）。 结论 CYP2C9基因多态性与房颤患者華法林抗凝治疗维持剂量有关系，可以部分解释华法林用药个体差异的原因。

[关键词] 房颤；CYP2C9；基因多态性；华法林；抗凝治疗

[中图分类号] R541.75 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2017）07（b）-0004-04

The role of the polymorphism of CYP2C9 in Warfarin anticoagulation therapy for patients with atrial fibrillation

LYU You YANG Jiefu

Department of Caidiology， Beijing Hospital， Beijing 100730， China

[Abstract] Objective To investigate the significance of CYP2C9 gene polymorphism in Warfarin anticoagulation therapy for patients with atrial fibrillation， in order to explore the causes of Warfarin individual difference. Methods The 3rd and 7th exon of CYP2C9 in 100 patients with atrial fibrillation given Warfarin anticoagulation therapy in Beijing Hospital were detected by PCR and restriction enzyme digestion. The genotype and allelic frequencies were calculated and patients information， coagulation function and the individual Warfarin dosage requirements were recorded. Results In this group of patients with atrial fibrillation given Warfarin anticoagulation therapy， two kinds of allele were detected： CYP2C9*1 and CYP2C9*3， the frequency of *1 allele and *3 allele was 96% and 4% respectively. CYP2C9*1/*1 was the most common genotype， with the frequency of 92%. The frequency of CYP2C9*1/*3 was 8% in these 100 patients. After similar target INR range （2.0-3.0） achieved， variant CYP2C9*1/*3 homozygotes or heterozygotes required lower daily mean maintain doses [（2.14±0.55） mg] than wild-type CYP2C9*1/*1 patients did [（3.17±0.74） mg]， with statistically significant difference （P < 0.05）. Conclusion Polymorphism of CYP2C9 is associated with Warfarin dose requirements in patients with atrial fibrillation， which is partly the factor causing Warfarin individual difference .

[Key words] Atrial fibrillation； CYP2C9； Genetic polymorphism； Warfarin； Anticoagulation therapy

心房颤动是临床中最常见的心律失常类型，心房颤动对患者的主要危害是缺血性脑卒中风险升高。为了预防房颤患者缺血性脑卒中的发生，临床中最常用的方法是进行华法林抗凝治疗。房颤患者华法林抗凝治疗的指征根据CHADS2评分：高血压病史1分，慢性心力衰竭病史1分，有卒中或短暂性脑缺血2分，年龄>75岁为1分，糖尿病病史为1分。对于积分≥2分的患者需进行抗凝治疗[1]。研究结果表明，恰当的华法林抗凝治疗可减少68%的卒中风险，使脑卒中的发生率从4.5%下降到1.4%[2]。华法林有着严格的治疗窗，目前华法林的临床治疗多根据国际标准化比值（INR）进行剂量的调整，要求维持INR在2.0～3.0之间，剂量不足难以达到预期抗凝疗效，而剂量过大则可引起出血。据统计华法林引起的致死性出血、严重出血、轻微出血发生率分别是0.6%、3%、9.5%，严重出血4年累计发生率约为25%[3]。中国人华法林的平均维持剂量为3.45 mg/d，但实际使用范围为1～60 mg/d[4]。造成华法林个体差异性大的原因诸多，包括年龄、体表面积、遗传、药物、饮食、饮酒、肝功能和其他未知因素。遗传因素中，肝药酶细胞色素P450中CYP2C9的基因多态性起到重要作用。本实验通过测定房颤患者的CYP2C9基因型和基因频率，并与临床中应用华法林后达到抗凝指标的平均维持剂量相比对，明确不同基因型的患者应用华法林维持剂量的差异，初步探寻华法林药物个体差异性的部分原因。

1 资料与方法

1.1 一般资料

2012年2月～2016年3月共收集北京医院（以下简称“我院”）服用华法林抗凝的房颤患者100例。入选标准：①中国汉族人群；②未同时服用影响华法林代谢的药物；③未患有影响凝血功能的疾病，如血液系统疾病、肝功能异常、恶性肿瘤等；④对本研究详细了解，获取完全知情同意的患者。本研究已通过我院伦理委员会审核批准。

1.2 方法

1.2.1 临床资料收集 对于符合入选标准的房颤患者，记录其基本临床资料，包括年龄、性别、身高、体重，追踪患者应用华法林抗凝治疗前、治疗达到稳定之后的凝血功能，以及华法林应用的维持剂量。

1.2.2 血标本采集 收集入选受试者的静脉血（枸橼酸钠抗凝）2 mL于-80℃冰箱贮存，用于检测CYP2C9基因型。

1.2.3 基因组DNA提取及PCR扩增 用EDTA抗凝真空采血管收集外周血2 mL，采用盐析法提取基因组DNA，-20℃储存备用。根据NCBI提供信息及相关文献[5]，CYP2C9*2为第3外显子430C>T突变，设计正向引物F：TACAAATACAATGAAAATATCATG，反向引物R：CT？鄄AACAACCAGGACTCATAAT；CYP2C9*3为第7外显子1075A>C突变，设计正向引物F：CCCCTGAATT？鄄GCTACAACAAA，反向引物R：ACCCGGTGATGGTAGAGGTT。PCR扩增：PCR扩增采用25 μL的反应体系，内含2×Taq mix（内含dNTP、PCR缓冲液、DNA聚合酶），100 ng的基因组DNA，上下游引物均为0.2 μmol/L。PCR扩增循环参数如下：94℃预变性5 min，94℃变性30 s，退火30 s，72℃延伸30 s，30个循环后再延伸5 min。

1.2.4 PCR产物浓度测定及电泳验证产物 取PCR扩增后产物5 μL，应用分光光度法测定产物浓度，均满足基因测试要求。CYP2C9第七外显子产物扩增长度为690 bp，第三外显子产物扩增长度为345 bp，通过电泳验证目标产物，见图1～2。

图2 CYP2C9第三外显子产物电泳图

1.2.5 INR值测定 取患者外周静脉抗凝血2 mL，分别测定用药前基础INR及应用华法林抗凝治疗达到稳定后的INR值，测定结果由我院检验科化验室提供。

1.3 统计学方法

采用SPSS 13.0统计学软件进行数据分析，计量资料数据用均数±标准差（x±s）表示，两组间比较采用t检验；计数资料用率表示，组间比较采用χ2检验，以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 患者基本特征

本次试验共入选100例房颤患者，其中，男64例，女36例；年龄为19～83岁，平均（63.17±13.18）岁；男性平均年龄为（62.66±14.51）岁，女性平均年龄为（64.63±12.74）岁，两组年龄差异无统计学意义（P > 0.05）。

2.2 患者基因及基因型检测结果

患者DNA测序服务由深圳华大基因研究院提供。根据患者DNA测序结果，应用Seqman及Chromas软件分析其目标位点突变情况，见图3～4。

箭头所指示的红色T位点是所要研究的位点，它的对应互补位点为A，该位置无杂峰，表示同源染色体为纯合子AA型，即野生纯合型

箭头所示第80编号T位，对应的互补位点为A，T峰下方可见黑色G峰，表示同源染色体为杂合子AC型，为杂合突变体

在研究的100例房颤患者中，以CYP2C9*1/*1基因型最为多见，基因型频率高达92%；其次，为CYP2C9*1/*3基因型，基因型频率为8%。未检出CYP2C9*1/*2、CYP2C9*2/*2、CYP2C9*3/*3型。等位基因以CYP2C9*1型最为常见，等位基因频率为96%，等位基因CYP2C9*3型等位基因频率为4%。

CYP2C9*1/*1基因型共有92例，其中，男59例，女33例；CYP2C9*1/*3基因型共有8例，其中，男5例，女3例。两组在年龄、性别分布、身高、体重方面差异均无统计学意义（P > 0.05）。见表1。

2.3 CYP2C9不同基因型患者的华法林维持剂量

在入选的100例房颤患者中，CYP2C9*1/*1基因型组的华法林维持剂量为（3.17±0.74）mg，CYP2C9*1/*3基因型组的华法林维持剂量为（2.14±0.55）mg，两组间剂量差异有统计学意义（P < 0.05）。

3 讨论

3.1 遗传因素在华法林个体差异性中的地位

华法林是由S-型和R-型组成的混合化合物。优映体为S-华法林，其主要通过细胞色素P450酶CYP2C9代谢，R-华法林主要通过CYP3A4、1A1、1A2代谢[6]。在所有的药物代谢酶中，CYP2C9酶对华法林代谢的影响最大，被研究的也最多。编码该代谢酶的基因为CYP2C9，野生基因型为CYP2C9*1/*1，主要的两种突变类型，即*2和*3突变。*2突变表现为430位点C>T，*3突变表现为1075位点A>C，两种突变类型均可使药酶活性降低[7]。在本实验的100例患者中，未检出*2的突变类型，这与其在黄种人群中分布规律相一致[8]。所检出的8例CYP2C9*1/*3突变型患者的华法林维持剂量低于野生型组的平均剂量，两组间剂量差异有统计学意义（P < 0.05）。再次验证了CYP2C9基因多态性在华法林个体差异性中的作用。

多项研究表明，维生素K环氧化物还原酶复合物（VKORC1）的基因多态性也影响着华法林的个体差异，维生素K经VKORC1作用由环氧化物转化成氢醌形式，参与体内凝血因子Ⅱ、Ⅶ、Ⅸ、Ⅹ及蛋白C、S的活化[9-10]。华法林的药理机制是通过抑制VKORC1的活性，抑制维生素K由環氧化物转化成氢醌形式，从而阻断凝血因子的活化，以达到抗凝的目的。自从Rost等[9]报道了VKORC1基因以来，已有多项研究证实，VKORC1基因多态性也影响着华法林的药物代谢。该基因主要突变的位点有-1173C>T、-3730G>A和-1639A>G。有文献报道，VKORC1基因的多态性对华法林剂量的影响可达25%，高于CYP2C9基因多态性对华法林的影响（6%）[11]。Miao等[12]研究发现，VKORC1-1639GA患者华法林平均每日剂量为（3.32±1.02）mg，高于野生型-1639AA的日均剂量（1.76±0.57）mg，差异有高度统计学意义（P < 0.01）。Yuan等[13]发现，日本缺血性卒中患者中，基因型为-1639GA的患者，其华法林日平均剂量[（3.70±1.11）mg]高于基因型为-1639AA的患者[（2.83±1.00）mg]，差异有高度统计学意义（P < 0.01）。意大利研究证实，VKORC1基因型为-1173CC的患者，其华法林的日平均剂量为6.2 mg，高于基因型为-1173CT和-1173TT的患者，差异有高度统计学意义（P < 0.01）[14]。综上可见，携带-1639G、-1173C及-3730A的患者，其对华法林的需求量较野生基因型患者高。本实验限于条件和经费的因素，并未将VKORC1的基因多态性同时进行研究，为一缺憾。

3.2 華法林药物模型建立的意义

由于华法林用药治疗窗口窄，个体差异大，影响因素繁多，需要临床反复监测凝血功能，并可能出现严重的出血并发症，因此在临床中的使用率一直较低[15]。1998年Oates等[16]研究了患者的多种临床因素与华法林剂量需求的关系。结果表明：性别、临床联合用药、心脏功能不全、连续使用华法林两周后的基线INR水平与华法林的维持剂量显著相关。Kamali等[17]建立包括年龄及CYP2C9基因多态性在内的给药模型，其相关系数为20.4%。自VKORC1基因与华法林剂量需求的关系被研究以后，有多篇文献报道了基于CYP2C9基因多态性和VKORC1基因多态性模拟出的华法林给药模型，这些模型的相关系数为40%～60%[18]。目前国际华法林药物遗传学联盟（the International Warfarin Pharmaeogenetics Consortium，IWPC）制订的IWPC华法林剂量预测算法[19]最具权威性，该研究纳入了4大洲9个国家/地区共计4043例以华法林治疗患者的临床和基因学资料进行分析，其包含的变量有CYP2C9、VKORC1、身高、体重、种族、是否同时使用酶诱导剂或胺碘酮等。

如果通过多因素的研究建立出符合汉族人群的华法林给药方案公式，在处方华法林前先对患者进行相关基因型的检测分析，并根据药物模型计算华法林的使用剂量，无疑将会对房颤患者临床抗凝治疗产生积极深远的作用，值得广大医学研究者进行深入探索。

综上所述，CYP2C9基因多态性可以部分解释房颤患者华法林用药个体差异性的原因，CYP2C9*1/*3突变型患者的平均华法林维持剂量低于CYP2C9*1/*1野生型的平均维持剂量。华法林在临床应用中受多种因素影响，大样本量、多因素的研究以及基于多因素的药物模型的建立，将对华法林的临床使用起到更好的指导作用。

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（收稿日期：2017-04-02 本文編辑：程 铭）