电纺聚乳酸-羟基乙酸共聚物/I型胶原-聚己内酯双层膜预防腱周粘连的相关研究

李鹏昊，刘舒云，王亚洁，全琦，王玉，汪爱媛，彭江，许文静，卢世璧，郭全义

电纺聚乳酸-羟基乙酸共聚物/I型胶原-聚己内酯双层膜预防腱周粘连的相关研究

李鹏昊，刘舒云，王亚洁，全琦，王玉，汪爱媛，彭江，许文静，卢世璧，郭全义

目的探讨聚乳酸-羟基乙酸共聚物/I 型胶原-聚己内酯双层膜的结构、成分、亲水性、组织相容性和细胞毒性，以及该膜对鼠 L929 成纤维细胞黏附和活性的影响，从而明确该电纺膜在预防肌腱断裂后腱周粘连的可行性。

方法制备单纯电纺聚乳酸-羟基乙酸共聚物膜和电纺聚乳酸-羟基乙酸共聚物/I 型胶原-聚己内酯双层膜。通过扫描电镜、红外光谱、接触角检测分析电纺膜的超微结构、成分以及亲水性能；通过溶血试验、热原试验、致敏试验和 MTT 法验证电纺膜的组织相容性和细胞毒性；将鼠 L929 细胞种植在单纯电纺聚乳酸-羟基乙酸共聚物膜和电纺聚乳酸-羟基乙酸共聚物/I 型胶原-聚己内酯双层膜上，体外培养 4 d后进行死/活细胞染色，通过共聚焦显微镜观察比较 L929细胞在两组膜上的黏附和活性情况。

结果两种电纺膜由纳米级-微米级的纤维丝有序排列，形成致密多孔的网状结构。且溶血试验、热原试验、致敏试验结果均呈阴性。MTT 检测发现，L929 细胞在电纺聚乳酸-羟基乙酸共聚物/I 型胶原-聚己内酯双层膜的 DMEM浸提液组和正常培养液组中的 OD570值的差异没有统计学意义（P ＞ 0.05）；死/活细胞染色提示，鼠 L929 成纤维细胞在电纺聚乳酸-羟基乙酸共聚物/I 型胶原-聚己内酯双层膜的 I 型胶原-聚己内酯层上第 4 天的黏附率和生存率显著高于对照组（P ＜ 0.05），而 L929 细胞在单纯电纺聚乳酸-羟基乙酸共聚物膜上的黏附率和生存率显著低于对照组（P ＜ 0.05）。

结论电纺聚乳酸-羟基乙酸共聚物/I 型胶原-聚己内酯双层膜是由纳米级-微米级有序排列的纤维丝构成的多孔膜片，而且组织相容性良好，无明显细胞毒性。其聚乳酸-羟基乙酸共聚物层可以有效抑制成纤维细胞的黏附和生存，I 型胶原-聚己内酯层可以促进细胞的黏附和存活。电纺聚乳酸-羟基乙酸共聚物/I 型胶原-聚己内酯双层膜对预防肌腱断裂后腱周粘连具有潜在的临床应用价值。

组织粘连； 生物相容性材料； 胶原 I 型；肌腱断裂； 静电纺丝

www.cmbp.net.cn 中国医药生物技术, 2017, 12(4):289-296

肌腱断裂是一种常见的运动损伤。由于血供较少，肌腱断裂后很难自愈，而是趋向于形成瘢痕组织和腱周粘连[1]。瘢痕组织脆性大，很容易出现再断裂；而腱周粘连减弱了肌腱的滑动能力，极大影响了邻近关节的运动。为了避免瘢痕组织和腱周粘连的发生，临床上采取早期手术修复，并配合康复理疗的治疗策略，效果良好[2]。但是，很多患者需要快速回归到以前的工作和运动中，不能接受长时间的康复理疗。

物理屏障，给肌腱断裂患者的康复带来新希望。一般而言，物理屏障应该具备以下特点：抑制腱周组织中大量成纤维细胞在损伤的肌腱周围自发黏附，阻断腱周粘连的发生；有孔隙，利于腱周组织为肌腱渗透营养；组织相容性良好，无毒性，降解完全，而且降解产物对机体无害；易弯曲，可以稳定缠绕在肌腱断裂处。静电纺丝技术可以将有机高分子材料电纺成为由纳米级或是微米级有序排列的纤维丝组成的多孔膜片[3]。电纺膜的性质取决于所用的高分子材料。在组织修复方面有许多常用的医用材料符合物理屏障的几点要求。其中，聚乳酸-羟基乙酸共聚物（poly lactic-co-glycolic acid，PLGA）是单体为乳酸和羟基乙酸的共聚物，其降解速率根据两种单体比例的不同而变化；I 型胶原是天然高分子材料，更是肌腱主要的组成成分。聚己内酯（polycaprolactone，PCL）具有良好的力学强度，在 I 型胶原中加入少量的 PCL，可以提高电纺膜的稳定性[4]。为了探索电纺 PLGA/I 型胶原-PCL 双层膜在肌腱断裂后预防腱周粘连并促进肌腱自然愈合的可行性，本实验将考察电纺单纯PLGA 膜和以 PLGA 作为外膜，I 型胶原和少量PCL 作为内膜的 PLGA/I 型胶原-PCL 双层膜的一般性质和安全性，以及鼠 L929 成纤维细胞在两组膜上的黏附和活性情况。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试剂和仪器 二氯甲烷（纯度 99.9%）、六氟异丙醇（纯度 99.5%）购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；牛跟腱 I 型胶原购自南京奥多福尼生物科技有限公司；PLGA（乳酸∶乙二醇 = 75∶25，Mw 66 000～107 000）、PCL（Mn 80 000）和 DMEM培养基、0.25% 胰蛋白酶、MTT、二甲基亚砜（DMSO）、死/活细胞染色试剂盒均购自美国Sigma 公司；胎牛血清（FBS）购自美国 Gibco 公司；SS 系列静电纺丝设备购自永康乐业科技发展有限公司；85-2 型恒温磁力搅拌器购自江苏常州国华仪器公司；BB5060 型 CO2培养箱购自德国Heraeus 公司；IX 70 型荧光显微镜购自日本Olympus 公司；S-4800 型扫描电镜购自日本Hitachi 公司；Tensor 27 型红外光谱仪购自德国Bruker 公司；Theta 型光学接触角测量仪购自芬兰Biolin 公司；A1R-si 型共聚焦激光扫描显微镜购自日本 Nikon 公司；Epoch Take 3 酶标仪购自美国 Bio-Tek 公司；ES-II 型热原管购自日本 Wako公司。

1.1.2 实验动物 健康 SD 大鼠 20 只，雌雄不限，体重 100～200 g；健康新西兰白兔 1 只，雌雄不限，体重 2.5 kg，均购自解放军总医院实验动物中心。所有动物实验方案均经解放军总医院伦理委员会批准。

1.2 方法

1.2.1 电纺 PLGA/I 型胶原-PCL 双层膜的制备 称取 2.0 g PLGA，在磁力搅拌下完全溶解于20 ml 的二氯甲烷中，配成 10% 质量体积比的PLGA 溶液；称取 1.3 g I 型胶原完全溶解在 20 ml六氟异丙醇中，配成 4% 质量比的 I 型胶原溶液；称取 1.3 g PCL 完全溶解在 20 ml 六氟异丙醇中，配成 4% 质量比的 PCL 溶液。取出 5 ml PCL 溶液与 20 ml 的 I 型胶原溶液混合，形成 80% 质量比的 I 型胶原-PCL 混合溶液。在 18 000 r/min 高速转动的接收装置外周，缠绕一层锡纸。设定电纺参数：溶液量：5 ml；电压：15 kV；电场距离：15 cm；喷头内径：11 mm；溶液推注速度：500 mm/min；喷头平移速度：20 cm/min；喷头平移范围：5 cm。先电纺 I 型胶原-PCL 混合溶液，作为电纺膜的内层；随即电纺 PLGA 溶液，作为膜的外层。电纺完毕后，所得电纺双层膜静置 24 h 后取下保存。在制备单纯 PLGA 膜时，取用 10 ml PLGA 溶液，采用相同的参数电纺。

1.2.2 扫描电镜观察 使用扫描电镜观察电纺膜的内表面细微结构。经过 75% 酒精擦拭后的单纯PLGA 电纺膜和电纺 PLGA/I 型胶原-PCL 双层膜经过剪切，形成 0.5 cm × 0.5 cm 的小块，粘贴固定在 5 cm 的铝架上，并进行喷金处理。在 5000 eV和 10 mA 条件下进行观察。为测量电纺膜中纤维的直径大小，通过 Image J 软件对每种膜内表面的5 张图片中的 100 条纤维的直径进行测量，计算出两种电纺膜中纤维的直径。

1.2.3 红外光谱分析 将单纯 PLGA 电纺膜和电纺 PLGA/I 型胶原-PCL 双层膜剪切后，保留平整光滑的表面来进行红外光谱分析。样品处理后，放进光谱分析仪的反应仓中，以 1 cm-1的分辨率，在 4000～650 cm-1的吸收光谱范围内进行分析，根据吸收峰所对应的红外线的波长来确定电纺膜中所存在的官能团，从而确定单纯 PLGA 电纺膜和电纺 PLGA/I 型胶原-PCL 双层膜中的成分。

1.2.4 接触角 使用光学接触角测量仪测量电纺膜表面的接触角来反映电纺膜表面的亲水性。经过75% 酒精擦拭后的单纯 PLGA 电纺膜和电纺PLGA/I 型胶原-PCL 双层膜经过剪切，形成 1 cm× 1 cm 的小块，通过静滴法，水滴接触到单纯PLGA 电纺膜和电纺 PLGA/I 型胶原-PCL 双层膜平整的表面，形成接触角。相应的检测系统可以自动计算出每种电纺膜表面的接触角，并求出平均值。

1.2.5 电纺膜组织相容性检测 电纺膜的生理盐水浸提液是依据 GB/T 16812-2000 国家质量技术监督管理局批准的《医疗器械生物学评价第 12 部分：样品制备与参照样品》，按照电纺膜面积（cm2）：生理盐水体积（ml）= 6∶1 的比例制备。90 cm260Co辐照灭菌后的单纯 PLGA 电纺膜和电纺 PLGA/I 型胶原-PCL 双层膜分别浸泡在 15 ml 的 0.9%的生理盐水中，放置在 37 ℃ 的恒温箱中 24 h后，获得浸提液。

分别取蒸馏水、0.9% 的生理盐水和单纯PLGA 电纺膜浸提液和电纺 PLGA/I 型胶原-PCL双层膜浸提液各 2 ml 于洁净试管中，蒸馏水组作为阳性对照，生理盐水组作为阴性对照，在每只试管中注入 2 滴新鲜兔耳血。在 37 ℃ 环境中静置30 min 后，各管 1500 r/min 离心 5 min，通过管中的溶血情况来判断电纺膜的生理盐水浸提液是否会造成血细胞的裂解。

分别取 3 ml 单纯 PLGA 电纺膜和电纺PLGA/I 型胶原-PCL 双层膜的生理盐水浸提液于新的热原管中，充分搅匀后在 37 ℃ 环境中静置1 h，通过热原管内的粉末与浸提液反应后是否出现浑浊现象来判断电纺膜的生理盐水浸提液是否是致热原。

用单纯 PLGA 电纺膜和电纺 PLGA/I 型胶原-PCL 双层膜的生理盐水浸提液在酒精消毒后的SD 大鼠背部皮下注射形成皮丘，每组 10 只，持续 120 min 观察皮丘是否消失或是出现过敏反应，从而判断电纺膜生理盐水浸提液是否是过敏原。

1.2.6 MTT 检测 电纺膜的细胞毒性通过 MTT法检测。电纺膜 DMEM 浸提液的制备类似于电纺膜的生理盐水浸提液的制备方法。具体来讲，分别将 15 cm260Co 辐照灭菌后的单纯 PLGA 电纺膜和电纺 PLGA/I 型胶原-PCL 双层膜浸泡在 90 ml含有 10% FBS 的 DMEM 中，在 37 ℃ 环境下浸泡 24 h 后，制得单纯 PLGA 电纺膜和电纺PLGA/I 型胶原-PCL 双层膜的 DMEM 浸提液。取对数生长期的鼠 L929 细胞，0.25% 胰酶消化，计数，接种于 96 孔板中，使得每孔中包含 4000 个细胞和 0.3 ml 的含有 10% FBS 的 DMEM，在37 ℃ 的 5% CO2培养箱中培养。待完全贴壁后，分别换用单纯 PLGA 电纺膜和电纺 PLGA/I 型胶原-PCL 双层膜的 DMEM 浸提液，以及作为对照组的含有 10% FBS 的 DMEM。于培养后 1～4 d，每天取出 1 个 96 孔板，吸去每孔中培养液，并用 PBS 溶液漂洗 2 遍，并加入 20 μl 的 5 mg/ml的 MTT 液，37 ℃ 培养 4 h 后，再加入 150 μl 的DMSO，充分振荡 10 min 后，用酶联仪在 570 nm的波长下测定光密度（OD）。

1.2.7 死/活细胞染色 通过死/活细胞染色检验L929 成纤维细胞在电纺膜上的黏附率和生存情况。无菌条件下，将单纯 PLGA 电纺膜和电纺PLGA/I 型胶原-PCL 双层膜剪成直径为 1.4 cm的圆片，贴在 24 孔板底部；24 孔板底部不贴电纺膜的一组作为空白对照组，在空白对照组、单纯PLGA 电纺膜和电纺双层膜的 I 型胶原-PCL 层接种 L929 细胞。每组设 3 复孔，60Co 辐照灭菌。用 0.25% 胰酶将鼠 L929 成纤维细胞消化、计数、重悬，制备密度为 5 × 104/ml 的细胞悬液，在每孔中加入 2 ml 细胞悬液。37 ℃、5% CO2恒温培养箱培养，每隔 1 天更换细胞培养液。细胞培养第4 天，吸去每孔中的细胞培养液，PBS 溶液清洗L929 细胞/电纺膜复合物。将 L929 细胞/电纺膜复合物用浓度为 5 × 10-3mg/ml 的二乙酸荧光素（FDA）室温、黑暗条件下孵育 5 min；吸去 FDA，PBS 溶液清洗 2 次；随后，使用浓度为 5 ×10-3mg/ml 的碘化丙啶（PI）在室温、黑暗条件下孵育 5 min；吸去 PI，PBS 溶液清洗 2 次后，共聚焦激光扫描显微镜观察 L929 细胞在各组的黏附和活性情况。

1.3 统计学处理

实验数据采用统计软件 SPSS ver.17.0 分析处理，以±s表示。两组间均数比较采用 t 检验，以 P ＜ 0.05 认为差异存在统计学意义。

2 结果

2.1 表面性质

扫描电镜结果显示，通过 18 000 r/min 高速转动的接收装置，可以获得电纺纤维有序排布的单纯PLGA 电纺膜和电纺 PLGA/I 型胶原-PCL 双层膜。而且，两种电纺膜均为多孔结构（图 1）。计算纤维直径发现，单纯 PLGA 电纺膜的纤维直径为（3.736 ± 0.878）μm，而电纺 PLGA/ I 型胶原-PCL双层膜中 I 型胶原-PCL 层的纤维直径为（0.462 ±0.110）μm。通过接触角的测量，发现单纯 PLGA 电纺膜的接触角为 121.13° ± 6.38°，为疏水性；电纺PLGA/I 型胶原-PCL 双层膜的 I 型胶原-PCL 层的接触角是 73.87° ± 4.48°，为亲水性。

2.2 成分检测

通过红外光谱检测发现，在单纯 PLGA 电纺膜中，存在两个特征吸收峰：1748 和 1085 cm-1（图 2A）；在电纺 PLGA/I 型胶原-PCL 双层膜中，除 3307、2944、1725 和 1167 cm-1四个特征吸收峰外，还存在许多相对矮小的吸收峰（图 2B）。

图1 电纺膜表面的结构和接触角（A：单纯 PLGA 电纺膜；B：电纺双层膜的 I 型胶原-PCL 层）Figure 1 The surface structure and water contact angle of the electrospun membranes (A: Pure PLGA electrospun membrane;B: The type-I collagen-PCL layer of the double-layer electrospun membrane)

2.3 溶血试验

体外溶血试验结果显示，经过 30 min 静置和离心后，蒸馏水组中兔血发生了溶血现象，血色素在浸提液中呈现红色；而在 0.9% 生理盐水组、单纯 PLGA 电纺膜组和电纺 PLGA/I 型胶原-PCL双层膜组中，兔血未发生溶血，红细胞未破碎，并沉淀在试管底部，上清液中为无色透明的浸提液，未见明显的红色（图 3）。

图2 电纺膜的成分 （A：单纯 PLGA 电纺膜；B：电纺双层膜）Figure 2 Ingredients of the electrospun membranes (A: Pure PLGA electrospun membrane; B: Double-layer electrospun membrane)

图3 30 min 时溶血试验结果Figure 3 Results of hemolysis test at 30 min

2.4 热原试验

未加入浸提液前，热原管内装有热原的检测试剂（图 4A）。加入单纯 PLGA 电纺膜和电纺PLGA/I 型胶原-PCL 双层膜生理盐水浸提液的热原管在 1 h 静置后，热原管中试剂溶解，溶液清澈透明，未出现浑浊（图 4B、C）。

2.5 致敏试验

分别将单纯 PLGA 电纺膜和电纺 PLGA/I 型胶原-PCL 双层膜的生理盐水浸提液注入鼠皮下，可见形成皮丘（图 5A、B）。经过 120 min 的持续观察，并未见鼠皮肤出现过敏症状，皮丘消退完全（图 5C、D）。

2.6 细胞毒性

图4 1 h 时体外热原试验结果（A：未使用的热原管；B：单纯 PLGA 电纺膜浸提液；C：电纺双层膜浸提液）Figure 4 Results of pyrogen test at 1 h (A: Unused pyrogen tubes; B: The leaching liquid of pure PLGA electrospun membrane; C: The leaching liquid of double-layer electrospun membrane)

鼠 L929 细胞在含有 10% FBS 的 DMEM、单纯 PLGA 膜的 DMEM 浸提液和 PLGA/I 型胶原-PCL 双层膜的 DMEM 浸提液中均贴壁生长良好，细胞呈现梭形、三角形和圆形（图 6A）。经过MTT 处理，活细胞内线粒体中的琥珀酸脱氢酶与MTT 反应，形成蓝紫色结晶甲瓒，使 L929 细胞显示出相应颜色（图 6B）。DMSO 溶解细胞中的甲瓒后，用酶标仪在 570 nm 波长处测量 OD 值。结果显示，L929 细胞在单纯 PLGA 膜的 DMEM浸提液中的 OD570明显小于 L929 细胞在含有10% FBS 的 DMEM（对照组）中的 OD570，差异具有统计学意义（P ＜ 0.05）；L929 细胞在 PLGA/I型胶原-PCL 双层膜浸提液中的 OD570与对照组的 OD570无明显统计学差异（P ＞ 0.05）（图 6C）。

2.7 细胞黏附及活性观察

图5 致敏试验结果（A：0 min 单纯 PLGA 电纺膜浸提液；B：0 min 电纺双层膜浸提液；C：120 min PLGA 电纺膜浸提液；D：120 min 双层膜浸提液）Figure 5 Results of sensitization test (A: The leaching liquid of PLGA electrospun membrane at 0 min; B: The leaching liquid of double-layer electrospun membrane at 0 min; C: The leaching liquid of PLGA electrospun membrane at 120 min; D: The leaching liquid of double-layer electrospun membrane at 120 min)

图6 MTT 检验结果[A：鼠 L929 成纤维细胞（× 200）；B：MTT 处理后的鼠 L929 成纤维细胞（× 200）；C：MTT 处理后样品的 OD570值（*P ＜ 0.05）]Figure 6 MTT test [(A: Murine L929 fibroblasts (× 200); B: Murine L929 fibroblasts after MTT disposing (× 200); C: The OD570values of samples after MTT dispose (*P ＜ 0.05)]

图7 死/活细胞染色结果 （A：对照组；B：单纯 PLGA 电纺膜；C：电纺双层膜内层；D：L929 细胞的黏附数量；E：L929 细胞的生存率；标尺 = 20 μm；*P ＜ 0.05）Figure 7 Results of dead/live cells staining (A: Control group; B: Pure PLGA electrospun membrane; C: The inner layer of the double-layer electrospun membrane; D: The quantity of adhering L929 cells; E: The survival rate of L929 cells; Scale = 20 μm;*P ＜0.05)

在共聚焦激光扫描显微镜下观察 L929 细胞在培养第 4 天后黏附和活性情况，可见在单纯PLGA 膜上鼠 L929 成纤维细胞的黏附率和细胞生存率都明显少于对照组（P ＜ 0.05）；黏附在电纺PLGA/I 型胶原-PCL 双层膜内层上的鼠 L929 成纤维细胞数目与对照组的差异存在统计学意义（P ＜0.05），细胞贴壁形态较差，少部分已经呈现梭形，但细胞生存率与对照组相比无明显差异（P ＞ 0.05），且与单纯 PLGA 电纺膜上细胞生存率存在统计学差异（P ＜ 0.05）（图 7）。

3 讨论

肌腱缺少血液供应，在发生断裂后，其自愈过程偏向于瘢痕愈合，易出现腱周粘连。可降解高分子材料性质多样，有良好的组织相容性，无毒性，在医药领域应用很广。通过静电纺丝技术加工后，可降解高分子材料的性质被极大地丰富，也为肌腱断裂后预防腱周粘连带来新的希望。

通过扫描电镜的结果证实，静电纺丝技术可以实现纤维丝的有序排列；纤维丝的直径可以达到几百纳米到几微米的范围；纤维丝之间存在良好的孔隙[5]。有序排列的结构有利于诱导细胞按照相同方向生长[6]，这与肌腱内部结构是相似的（同向的I 型胶原的缝隙中包绕走行相同的细胞）。纤维丝可以达到一定的致密性，提高了材料的力学性能[7]，有利于电纺膜在机体局部稳定存在。多孔结构的电纺膜有利于腱周组织与肌腱之间的物质交换，促进肌腱愈合；同时，密集的孔隙起到滤网的作用，抑制腱周组织中成纤维细胞黏附在肌腱上形成粘连[8]。电纺膜的接触角结果显示，PLGA 的接触角大于90°，是疏水性的；I 型胶原-PCL 的接触角小于90°，是亲水性的。细胞黏附和增殖的能力随材料表面亲水性的升高而增强[9]，即 PLGA 可能具有抑制细胞黏附能力，而胶原可以促进细胞的黏附和生长[10]。红外光谱结果显示，PLGA 中存在 -C=O 和C–O–C 官能团[11]，而 PLGA/I 型胶原-PCL 双层膜的红外光谱显示，其中除了 -C=O 和 C–O–C 官能团，还有 N–H 键、肽键，这说明 I 型胶原已经混合到电纺双层膜中[9]，并没有随着电纺过程而丢失。

电纺膜的生理盐水浸提液在溶血试验、热原试验和致敏试验的检测结果均为阴性，表明电纺双层膜具有良好的组织相容性。而且其 DMEM 浸提液对鼠 L929 的增殖并没有明显的抑制作用[12]，表明电纺双层膜没有明显的细胞毒性。通过 MTT 结果说明，单纯 PLGA 电纺膜由于分解产物中含有乳酸，具有一定的细胞毒性；但加入 I 型胶原-PCL层后，细胞毒性消失，说明 I 型胶原-PCL 层不但没有细胞毒性，更吸收了 PLGA 降解释放的乳酸。死/活细胞染色结果可以明确显示细胞与材料相互作用后的黏附和生存情况[13]。本实验中，与对照组相比，鼠 L929 成纤维细胞在单纯 PLGA 电纺膜上黏附很差，而且细胞存活率明显低于对照组，而在 PLGA/I 型胶原-PCL 双层膜中，与对照组相比，L929 细胞黏附情况较低，但生存状况稍好。这说明 PLGA 电纺层有抑制 L929 细胞黏附、生存的能力，而 I 型胶原-PCL 电纺层可以维持并促进L929 细胞的生存。

总之，电纺 PLGA/I 型胶原-PCL 双层膜的I 型胶原-PCL 层具有维持细胞活性潜能，而PLGA 层可以抑制成纤维细胞的黏附和生存，从而预防肌腱断裂后腱周粘连的发生。电纺 PLGA/I 型胶原-PCL 双层膜是未来肌腱断裂领域理想的预防粘连材料。但是，本实验只检测了在静态时电纺膜的性能，在人体真实生物力学的条件下，电纺膜预防腱周粘连和促进肌腱愈合的能力还有待研究；而且，挑选或研发性能更佳的材料，在保证组织相容性的前提下提高电纺膜的效果，是本领域未来发展的重要方向。

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The related research of the PLGA/type-I collagen-PCL double-layer electrospun membrane’s ability of preventing peritendinous adhesion

LI Peng-hao, LIU Shu-yun, WANG Ya-jie, QUAN Qi, WANG Yu, WANG Ai-yuan, PENG Jiang, XU Wen-jing, LU Shi-bi,GUO Quan-yi

ObjectiveTo study the structure, composition, hydrophile, histocompatibility and cytotoxicity of the electrospun PLGA/type-I collagen-PCL double-layer membrane, and evaulate the effect of the membrane in mouse’s L929 fibroblasts’ adhesion and activity.

MethodsPure PLGA electrospun membrane and PLGA/type-I collagen-PCL double-layer electrospun membrane were produced via electrospinning.The membranes’ ultrastructure, ingredients and hydrophile were analyzed through scanning electron microscope,fourier transform infrared spectroscopy and water contact angle testing.The histocompatibility and cytotoxicity of the electrospinning membranes were verified through hemolysis test, pyrogen test, sensitization test and MTT test.In addition, mouse L929 fibroblasts were cultured on pure PLGA electrospun membrane and PLGA/type-I collagen-PCL double-layer electrospun membrane for four days, and then stained with FDA/PI, and the condition of the cells’ adhesion and activity were observed and compared using confocal microscopy.

ResultsWell-ordered nano-scale to micron-scale fibers formed dense porous mesh structure in two kinds of electrospun membranes.And the results of hemolysis test, pyrogen test and sensitization test were negative.The values of OD570had no significant statistical difference between the PLGA/type-I collagen-PCL double-layer electrospun membrane’s DMEM leaching solution +L929 cells group and the normal culture solution +L929 cells group (P ＞ 0.05), determined by MTT test.In addition, on the fourth day, the mouse’s L929 fibroblasts’ proliferation and activity on the PLGA/type-I collagen-PCL double-layer electrospun membrane was significantly higher than that of control group (P ＜ 0.05), and the mouse’s L929 fibroblasts’ proliferation and activity on the pure PLGA membrane was significantly lower than that of control group (P ＜ 0.05).

ConclusionThe PLGA/type-I collagen-PCL double-layer electrospun membrane is made into dense porous mesh structure with abundant well-ordered nano-scale to micron-scale fibers.The electrospun membrane is histocompatible and nontoxic.Its PLGA layer could effectively inhibit the adhesion and activity of fibroblasts, and its type-I collagen-PCL layer could promote cell adhesion and survival.The PLGA/type-I collagen-PCL double-layer electrospun membrane has potential clinical application value for the prevention peritendinous adhesion after tendon rupture.

Tissue adhesions; Biocompatible materials; Collagen type I; Tendon rupture; Electrospinning

s:GUO Quan-yi, Email: doctorguo_301@163.com; LU Shi-bi, Email: shibilu301@yahoo.com.cn

10.3969/j.issn.1673-713X.2017.04.001

国家自然科学基金（21134004）；国家高科技研究发展计划（863 计划）（2012AA020502、2015AA020303）；骨科再生医学北京市重点实验室 2016年度科技创新基地培育和发展项目子专项（Z161100005016059）

300071 天津，南开大学医学院（李鹏昊、王亚洁）；100853北京，中国人民解放军总医院骨科研究所骨科再生医学北京市重点实验室/全军骨科战创伤重点实验室（刘舒云、全琦、王玉、汪爱媛、彭江、许文静、卢世璧、郭全义）

郭全义，Email：doctorguo_301@163.com；卢世璧，Email：shibilu301@yahoo.com.cn

2017-03-15

Author Affiliations:The College of Medicine, Nankai University, Tianjin 300071, China (LI Peng-hao, WANG Ya-jie); Institute of Orthopaedics, Chinese PLA General Hospital/Beijing Key Laboratory of Regenerative Medicine in Orthopaedics and Key Laboratory of Musculoskeletal Trauma & War Injuries, Beijing 100853, China (LIU Shu-yun, QUAN Qi, WANG Yu, WANG Ai-yuan, PENG Jiang, XU Wen-jing, LU Shi-bi, GUO Quan-yi)

www.cmbp.net.cn Chin Med Biotechnol, 2017, 12(4):289-296