动态浊度法测定丙泊酚中细菌内毒素含量

杨柳

（重庆市食品药品检验检测研究院·重庆市药物过程与质量控制工程技术研究中心，重庆 401121）

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动态浊度法测定丙泊酚中细菌内毒素含量

杨柳

（重庆市食品药品检验检测研究院·重庆市药物过程与质量控制工程技术研究中心，重庆 401121）

目的建立丙泊酚中细菌内毒素定量测定的动态浊度法。方法通过测定供试液中外加内毒素的回收率进行干扰试验，确定样品无干扰浓度，定量测定样品中的细菌内毒素含量。结果内毒素检测浓度线性范围为0.031 25～2.0 EU／mL（r＝－0.995 4）；样品在稀释成1.25 g／L及以下时对试验无干扰作用，细菌内毒素回收率为50% ～200%；3批样品的内毒素定量测定结果符合规定。结论丙泊酚中细菌内毒素的定量检测用动态浊度法可行。

丙泊酚；细菌内毒素；动态浊度法；含量

丙泊酚为烷基酸类短效静脉麻醉药，麻醉作用起效快、苏醒完全而且较快、术后恶心呕吐发生率低、不良反应少[1－3]。经静脉注射后，可使患者非常快速地进入睡眠状态，因而使麻醉迅速而平稳，目前临床普遍用于麻醉的诱导和维持[4]、重症监护室中危重患者镇静，同时也应用于硬膜外或脊髓麻醉，常与镇痛药、肌松药及吸入性麻醉药同用。2015年版《中国药典（二部）》收载的丙泊酚原料未对细菌内毒素作出规定，而细菌内毒素是控制药物注射剂重要的安全性指标[5]，作为原料药更应严格控制其细菌内毒素含量。因此，本研究中参照2015年版《中国药典(四部)》通则1143中细菌内毒素检查方法，探讨用动态浊度法测定丙泊酚中细菌内毒素含量的可行性，并检测了3批样品的细菌内毒素含量。现报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器

BET－32M型细菌内毒素测定仪（天津市天大天发科技有限公司）；VG3 S25型漩涡混匀器（德国IKA公司生产）；移液器（德国艾本德＜EPPENDORF＞，规格为250 μL，1 000 μL）；无热原空安瓿（湛江安度斯生物有限公司，批号为1603170，规格为5 mL）；无热原吸头（湛江安度斯生物有限公司，批号为1601040，1601260，规格为250 μL，1 000 μL）。

1.2 试药

丙泊酚（原料，重庆博腾制药科技股份有限公司，批号为130002，130003，13004）；细菌内毒素工作标准品（中国食品药品检定研究院，批号为150601－201580，规格为每支80 EU）；定量鲎试剂（湛江安度斯生物有限公司，批号为1411260，规格为每支1.25 mL，检测范围10～0.01 EU／mL，有效期至2017年10月）；细菌内毒素检查用水（BET用水，湛江安度斯生物有限公司，批号为1207020，规格为每支5 mL）。

2 方法与结果[6－8]

2.1 确定供试品细菌内毒素限值（L）

按2015年版《中国药典（四部）》细菌内毒素检查中的公式 L＝K／M，式中 L表示供试品的细菌内毒素限值，K表示人每kg体质量每小时最大可接受的内毒素剂量，M表示人用每kg体质量每小时的最大供试品剂量，计算出供试品的细菌内毒素限值。供试品作为注射液的原料，注射液的 K＝5 EU／（kg·h），通常丙泊酚注射液临床的最大用量为成人 M＝15 mg／（kg·h）的给药速率。计算得，L＝0.33 EU／mg。出于对药品使用安全的考虑，作为原料时更应严格控制其质量，根据计算值适当调整，按计算限值的1／3计，将本品的细菌内毒素限值定为0.10 EU／mg。

2.2 建立细菌内毒素标准曲线

将1支定量鲎试剂加入1.25 mL BET用水复溶，并在11支反应试管中分别加入0.1 mL复溶的鲎试剂；将细菌内毒素工作标准品用BET用水进行稀释，制成含细菌内毒素浓度为0.031 25，0.25，2.0 EU／mL的溶液（相邻浓度间稀释倍数为8），再将这3个浓度的的内毒素溶液分别加入到含有0.1 mL鲎试剂的反应试管中，每个浓度做平行的 3管，充分混匀，插入 BET－32M型细菌内毒素检测仪内，同时做阴性对照2管 。当阴性对照的反应时间大于标准曲线最低点的反应时间时结束反应。将全部数据进行线性回归分析，得到标准曲线回归方程为 lg T＝－0.268 43 lg C＋2.903 7。其中，lg C横坐标，为内毒素浓度的对数；lg T纵坐标，为平均反应时间的对数。结果 r＝－0.995 4(绝对值应不小于0.980)，平行管之间的 RSD均小于10%，阴性对照在规定检测时间外，试验有效，细菌内毒素标准曲线成立。见表1。

表1 细菌内毒素标准曲线及可靠性分析

2.3 确定供试品最大可稀释倍数

称取本品(批号为130002)100 mg，制成100 g／mL，L为0.10 EU／mg，标准曲线最低浓度(λ1)为0.031 25 EU／mL，供试品的 MVD＝CL／λ1＝320，故最小有效稀释质量浓度为0.312 5 g／L。

2.4 供试品干扰试验

取内毒素标准曲线的中点浓度(λm)0.25 EU／mL，作为供试品干扰试验中添加的内毒素浓度。选择样品（批号为130002）做干扰试验。供试品溶液（A液）制备：按最大可稀释倍数，将供试品用BET用水分别稀释成质量浓度为5，2.5，12.5，0.625，0.312 5 g／L的溶液；内毒素浓度 λm（0.25 EU／mL）的供试品溶液（B液）制备：将上述浓度的供试品溶液中分别加入0.25 EU／mL的内毒素工作标准品。取 20支反应试管，分别加入0.1 mL复溶的定量鲎试剂，再分别加入A液、B液，每个浓度做2个平行，将其混合均匀，插入BET－32M型细菌内毒素检测仪内进行检测。检测结束后，按标准曲线回归方程分别计算出各个被测溶液的内毒素含量，并按 R＝（Cs－Ct）／λm×100%计算回收率。其中，R为回收率，Cs为B液内毒素含量，Ct为A液内毒素含量。结果见表2。

表2 干扰试验及样品细菌内毒素含量测定结果（n＝2）

2.5 干扰验证试验

由表2可知，当供试品稀释成 2.5 g／mL及以上时，其回收率为52%～103%，符合《中国药典》的要求，则在该试验条件下不存在干扰。但当质量浓度为2.5 g／L时，内毒素的回收率仅为52%，为使干扰作用降低到最小，更准确地测定内毒素的含量，因此建议采用1.25 g／L以上的稀释浓度进行测定。

另取两批（批号为130003，130004）样品，按干扰试验的方法分别制备质量浓度为1.25 g／L供试品溶液以及含相同供试品浓度并加有内毒素浓度为0.25 EU／mL的溶液，依法检查。结果B液回收率均在50%～200%，符合药典要求，且平均内毒素浓度乘以稀释倍数后，小于规定的内毒素限值，供试品符合规定。

3 讨论

家兔热原检查法和细菌内毒素检查法作为热原检查的两种基本方法收载于各国药典中，以前多用家兔法，其缺点有重复性差，操作烦琐，受家兔个体差异、环境的影响大且费时，被细菌内毒素检查法代替已经是一种趋势。细菌内毒素检查法操作简单，减少了动物的使用，灵敏度高，所受干扰少，耗时少。目前，细菌内毒素检查法有凝胶法（凝胶限度试验、凝胶半定量试验）、光度测定法（浊度法和显色基质法）。使用最多的方法为凝胶限度试验，该试验仅是对内毒素含量是否超过限度值作出判断，无法定量。有文献报道，如今国外对药品的细菌内毒素检查，采用定量方法测定的大于50%[9]。定量检测也是发展的趋势，能更直观地评价药品中细菌内毒素的含量，从而控制药品的质量，监控生产过程中的质量。目前最常用的定量检测方法的动态浊度法，灵敏度高，操作简单，可通过观察反应曲线来大致了解细菌内毒素的量，仪器能直接处理结果，减少人工计算的烦琐，降低错误的发生，更准确测定内毒素含量[10－11]。

丙泊酚原料的质量标准收载于2015年版《中国药典(二部)》中，但未对细菌内毒素作出限定。本试验中研究了用动态浊度法对丙泊酚原料的细菌内毒素进行定量测定，在供试品中加入已知浓度的内毒素，通过对加入内毒素的回收率为判断是否存在干扰，药典中规定当回收率在50%～200%，认为此试验条件下供试品溶液不存在干扰作用。本试验中，将供试品稀释成质量浓度为1.25 g／L及以上时，回收率达到要求，此时对试验无干扰作用，并对3批供试品进行检查，结果均符合规定。因此，丙泊酚中细菌内毒素的含量的定量检测可采用动态浊度法，可为相关标准提供参考，从而从源头上控制产品的质量，提高了原料安全性，也保证了制剂的安全性，保证用药安全。

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Content Determination of Bacterial Endotoxin in Propofol by Kinetic Turbidimetric Assay

Yang Liu
(Chongqing Institute for Food and Drug Control,Chongqing Engineering Research Center for Pharmaceutical Process and Quality Control, Chongqing,China 401121)

Objective To establish a kinetic turbidimetric assay(KTA)method for determine the concentration of bacterial endotoxin in propofol.M ethods Bacterial endotoxin was added into test sample for interference test,and the recovery rate was determined,no interference concentration was determined for the sample.The linear range and bacterial endotoxin in samples were determined.Results The linear range of bacterial endotoxin was 0.031 25－2.0 EU／mL(r＝－0.995 4).The sample had no interference to the test when it is diluted to 1.25 g／L and below.The recovery rate of bacterial endotoxin was 50% －200%.The concentration of endotoxin in the 3 batches of samples met the requirements for bacterial endotoxins.Conclusion The KTA method is suitable for the content determination of bacterial endotoxin in propofol.

propofol;bacterial endotoxin;kinetic turbidimetric assay;content

R927.11

A

1006－4931(2017)13－0028－03

2017－03－29)

10.3969／j.issn.1006－4931.2017.13.008

杨柳（1980－），女，硕士研究生，主管药师，研究方向为药品、药包材质量标准，（电话）023－86072759（电子信箱）18775786＠qq.com。