Toll样受体对肝纤维化的调控作用进展*

杨 超，谭勤锐 综述，李 晖 审校

(1.成都中医药大学临床医学院,成都 610075；2.成都中医药大学附属医院中心实验室,成都 610072)

Toll样受体对肝纤维化的调控作用进展*

杨 超1，2，谭勤锐1,2综述，李 晖2△审校

(1.成都中医药大学临床医学院,成都 610075；2.成都中医药大学附属医院中心实验室,成都 610072)

肝纤维化;Toll样受体;调控

感染、物理、化学、免疫等因素导致的各种损伤，均可引起细胞内环境发生变化，形成新的分子模式，模式识别受体(PRRs)通过识别改变后的分子模式，触发特异性应答进行组织功能修复，其中包括炎症和创伤修复[1]。Toll样受体(Toll-like receptors，TLRs)属于模式识别受体家族，且高度保守，能识别外源性配体——病原相关分子模式(pathogen-associated molecular patterns，PAMPs)和内源性配体——损伤相关分子模式(damage-associated molecular patterns，DAMPs)，被认为是多种慢性疾病导致炎症反应的触发器[2]。

肝纤维化是指各种致病因素引起肝脏慢性损伤和炎症，刺激大量细胞外基质(extra cellular matrix，ECM)释放，ECM合成和降解失衡，导致ECM过度沉积的结果，肝纤维化是多种慢性肝病共同的病理基础，也是慢性肝病向肝硬化、肝癌发展的重要环节[3]。肝纤维化与肝脏的慢性炎性反应紧密相关，而作为炎症反应触发器的TLRs在肝纤维化的发生、发展过程中发挥重要作用。

1 TLRs

TLRs是一组重要的模式识别受体，最早于1988年在果蝇体内发现。迄今为止，人体内共发现10个TLRs(TLR1～TLR10)，小鼠体内共有12个 TLRs(TLR1～TLR9，TLR11～TLR13)[4]。TLRs构成机体防御病原体入侵的第一道屏障，主要表达于肥大细胞、巨噬细胞、树突细胞、上皮细胞、成纤维细胞、中性粒细胞、自然杀伤细胞(natural killer cells,NK)、γδ T细胞等表面[1,5]，而在肝脏，主要在肝星状细胞(hepatic stellate cells,HSCs)、肝细胞和Kupffer细胞(KCs)上表达。TLR1、TLR2、TLR4、TLR5、TLR6和TLR10定位于细胞表面，而TLR3、TLR7、TLR8和TLR9则定位于细胞内的内涵体、溶酶体等。

TLRs是一种高度保守的Ⅰ型跨膜蛋白，它分为胞外区、 跨膜区及胞内区3个功能区。胞外区由富含亮氨酸的重复序列(leucine-rich repeats，LRRs)组成，非LRR序列在其间分隔。髓样分化因子 2(myeloid differentiation factor-2，MD-2)是一种辅助蛋白，它在结构上有 2 个具有相对独立功能的结构域，不仅能和TLRs的胞外区结合而定位于细胞表面，还能参与对病原微生物的某些高度保守的特定分子结构即PAMPs的识别[6]，从而增强受体的稳定性，促进TLRs对配体识别的敏感性及反应性，并能增强信号转导的效应。因此胞外区决定着 TLRs 与相关配体特异性结合的部位，发挥着识别病原微生物或产物的作用。而胞内区是TLRs 信号转导的核心区域，其结构与人类白细胞介素-1(interleukin 1，IL-1)相似，被称为 Toll/IL-1R (TIR)结构域，是 TLR 与下游信号分子相互作用并介导下游信号传导的核心作用元件[7]。

TLRs作为一种模式识别受体，需与相应配体结合才能激活。按照来源其配体可分为外源性配体和内源性配体。外源性配体主要来自病原微生物， 即PAMPs，是微生物进化过程中的保守成分，其中位于细胞表面的TLRs主要识别微生物细胞膜成分，TLR1、TLR2和TLR6主要识别G+菌细胞壁成分，如肽聚糖、N-酰基脂蛋白、甘露聚糖、酵母聚糖、脂膜酸等，TLR4则识别G-菌细胞壁成分脂多糖(LPS)，TLR5识别细菌鞭毛蛋白，TLR10则可识别位于李斯特菌和A型流感病毒上的配体；位于细胞内的TLRs主要识别细菌或病毒核酸，TLR3识别病毒双链RNA、小干扰RNAs，TLR7识别病毒单链RNA，TLR8识别病毒或细菌的RNA，TLR9识别非甲基化 DNA(CpG DNA)[1,4]。内源性配体即DAMPs，在细胞外基质降解、组织损伤、机体应激时释放，如高迁移率族蛋 B1(HMGB1)、透明质酸、热休克蛋白等，大多数通过TLR2和TLR4介导[8]。

2 TLRs信号转导通路

髓样分化因子88(myeloid differentiation factor 88,MyD88)是 TLRs信号转导途径中最主要的接头蛋白，它主要通过TIR与 TLRs/IL-1R结合，向胞内传递信号，激活核因子- κB(NF-κB)等转录因子，引起多种炎性细胞因子及抗凋亡分子的释放，参与人体固有免疫[9]。TLRs 信号通路可分为 MyD88依赖信号通路和Trif(Toll-interleukin-1 R domain-containing adaptor inducing interferon-b)依赖信号通路，除TLR3外，其他TLRs均通过MyD88 信号通路传导，而TLR4信号则可通过MyD88 和Trif两条信号通路下传，MyD88和Trif依次触发多条促炎信号通路，包括NF-κB，JNK/AP1，ERK和P38信号通路，也可通过干扰素调节因子(IRF)激活干扰素信号通路[10-11]。

TLR激活还能触发调节性反馈环，称为TLR耐受(TLR tolerance)，对TLR活性的负调节通过一系列分子机制进行，包括影响TLR与配体的结合，TLR水平下调和降解，抑制下游信号，通过染色质重塑、组蛋白修饰等改变TLR作用靶点结构等[1]。

3 TLRs对肝纤维化的调控作用

病毒性肝炎、酒精性肝病和非酒精性脂肪性肝炎所引起的慢性肝脏炎症是导致肝纤维化的主要原因，肝纤维化可进展成为肝硬化、肝细胞癌(HCC)和肝衰竭等终末期肝病。而TLRs通过识别PAMPs和DAMPs，触发一系列炎症级联反应，在肝纤维化的发生、发展过程中具有重要作用。

3.1 TLR4与肝纤维化 TLR4 属于细胞表面TLRs，同时也是迄今为止研究最多的TLRs，对人体免疫系统，尤其是固有免疫应答有重要调控作用。TLR4在肝脏主要分布在HSCs、肝内皮细胞、KCs等，识别LPS和DAMPs[12]。

LPS作为TLR4的主要外源性配体，是G-细菌细胞壁的主要成分。LPS/TLR4 信号转导是一个十分复杂的过程。LPS首先与 TLR4 的胞外区域结合， 这个过程需要LPS结合蛋白(LBP)、CD14和MD-2的参与。LPS与 TLR4结合后引起受体络合物的构象发生改变，进而引起胞内接头蛋白的聚集，最终引发信号级联反应，最终激活转录因子如NF-κB和活化蛋白1(AP-1) 及IL调节因子，这些转录因子能引起参与炎症反应、抗病毒应答、抗细菌应答及调控细胞生存和凋亡基因的转录[13]。

基于解剖位置，肝脏不断受到通过门静脉进入的肠源性细菌成分，主要是LPS的刺激，而生理状态下的肝脏具有耐受低水平LPS的能力，可避免产生持续性的肝脏炎症，TLR4、MD-2和MyD88的低水平表达即可证实这一点。当慢性肝病患者肠源性细菌转位增加，血液循环中LPS水平上升，通过TLR4触发下游炎症反应，持续或重复性的肝损伤则可刺激肝细胞、HSCs和KCs之间产生不良的相互作用，导致胶原蛋白和其他细胞外基质蛋白在肝脏的沉积，最终引起肝纤维化，因此，TLR4在肝纤维化的形成过程中起到重要的调控作用，是各种病因导致肝纤维化的主要调节子[1,8]。

Seki 等[14]给大鼠饲喂大剂量非吸收性广谱抗生素，以有效抑制肠道中 LPS 进入肝脏，然后将大鼠胆道结扎(BDL)以造成肝纤维化模型，发现与对照组相比，在血浆 LPS 减少的同时，各项肝纤维化指标(collagen-1、Acta2、TGFβ1、TIMP1)均提示肝纤维化程度明显减轻。另有研究表明，槐果碱具有抗纤维化作用，主要机制是通过抑制体内促肝纤维化的细胞因子与TLR4的表达信号通路相关蛋白的表达，阻断LPS诱导的TLR4信号转导通路，影响HSCs的激活，减少炎症细胞因子的生成，如IL-6和TNF-α，达到槐果碱抗肝纤维化的作用[15-16]。而不同肝纤维化动物模型中TLR4、TLR4结合分子CD14、LPS辅助受体MD-2、MyD88及Trif等的表达缺失可提高个体抗肝纤维化能力[1]，进一步证实了TLR4信号在肝脏炎症反应及肝纤维化形成过程中的关键作用[1]。

此外，肝内皮细胞上的TLR4可调节纤维化相关新血管形成，但尚需在体内靶向性清除肝内皮细胞上的TLR4后加以证实[17]。慢性丙型肝炎病毒(HCV)感染，由于TLR4基因单核苷酸多态性(SNP)的存在，使患者对LPS的应答下降，可减轻肝纤维化进展程度[18]。血管紧张素转化酶抑制剂-培哚普利和血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)受体阻断剂-氯沙坦治疗肝纤维化大鼠后，其血清透明质酸和层黏连蛋白的含量明显下降，同时肝脏中PDGF和TGF-β1表达下降，而AngⅡ在多种细胞中能直接促进TLR4的表达，如大鼠腹膜间皮细胞、小鼠系膜细胞等，说明培哚普利和氯沙坦可能通过拮抗AngⅡ，从而抑制TLR4的表达，减轻肝组织的损害，进而发挥抗纤维化作用[19]。另有研究表明，肠源性微生物成分激活TLR4，可促进慢性肝脏疾病进展至HCC[20]。

除LPS外，TLR4也被内源性配体——DAMPs激活，如HMGB1、热休克蛋白等。HMGB1是HMGB家族的成员之一，是结合DNA的非组蛋白核蛋白，主要功能是体细胞转录调控。一方面，HMGB1可以由多种细胞如巨噬细胞、单核细胞、NK细胞、树突状细胞(DCs)、内皮细胞、血小板等分泌，另一方面，细胞坏死或损失后也可被动释放HMGB1。有研究发现，HMGB1与肝纤维化发生密切联系，呈现促肝纤维化效应，可上调肝纤维化进展关键细胞——HSCs的α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的表达水平，抑制降解胶原蛋白的基质蛋白酶-2(MMP-2)活性，促进HSCs转化为成肌纤维细胞[21]；肝纤维化大鼠HMGB1水平上调，与胶原蛋白沉积密切相关，采用小干扰RNA(siRNA)抑制HMGB1表达可减少转染HSCs合成α-SMA和生成胶原蛋白[22]；姜黄素通过减少TLR2和HMGB1的表达，抑制促炎症介质和HSCs的活化，达到有效治疗肝纤维化的目的[23]；HMGB1可刺激HSCs的迁移，增强JNK、PI3K/Akt信号通路及NF-κB的激活，但采用中和抗体阻断TLR4后，上述作用均受到抑制，说明HMGB1诱导下的HSCs增殖、迁移及促纤维化效应均依赖于TLR4信号转导通路[24-25]。抑制HMGB1/TLR4结合或HMGB1的表达可能是肝纤维化治疗的潜在靶标。

3.2 TLR9与肝纤维化 TLR9 是 TLRs 家族在人体中分布区域最为狭窄的，主要分布在DCs和HSCs，属于细胞内TLRs。TLR9的主要配体是CpG DNA，二者结合后通过MyD88 依赖途径激活下游IRAK/TRAF 通路，激活干扰素调节因子7(IFN regulate factor 7，IRF7)使 IFN-α 水平升高，激活 NF-κB 信号通路，分泌系列炎症因子，并激活 MAPK 通路[26-27]。

研究发现，TLR9既识别CpG DNA，还可识别凋亡肝细胞释放的变性DNA片段，激活HSCs，促进肝纤维化[28]；凋亡肝细胞释放的变性DNA片段，与细胞内TLR9结合，激活一系列信号级联，导致HSCs分化成为成肌纤维细胞，TGF-β1因子和1型胶原水平上调，且上调作用可被TLR9拮抗剂阻断；经CCl4、BDL、脂肪性肝病等造模处理后，TLR9缺陷小鼠的肝纤维化程度较野生型小鼠更轻[29-30]。通过非酒精性脂肪性肝炎动物模型研究发现，TLR-9缺陷小鼠的脂肪性肝炎和肝纤维化程度较野生型小鼠更轻，IL-1β产生受到抑制。表达在DCs上的TLR9对于肝纤维化是关键因素，去除DC的动物肝纤维化明显减轻，CpG DNA能够刺激纤维化肝脏的DCs产生TNF-α、IL-6和其他化学因子，从而激活HSCs[31]。上述研究结果均提示TLR9具有促肝纤维化作用。

但另有研究表明，TLR9还有抗肝纤维化的作用，TLR9激活可抑制CD8细胞，刺激NK细胞增生，增加NK细胞的细胞毒性，肝NK细胞可通过直接杀死活化的HSCs起到抗肝纤维化的作用[32]，从而表现抗肝纤维化作用，而另一方面，具有促肝纤维化和促炎症作用，α-SMA表达增加，ALT血清水平升高。而且对于淋巴细胞和HSCs的TLR9激活也可产生不一样的效应，纤维化结果各异。因此TLR9对于肝纤维化的影响具有双重性，最后结局取决于二者之间达成的平衡[33]。

3.3 其他TLRs与肝纤维化 TLR2对于肝纤维化的影响存在争议。研究表明，给予高脂饮食后，TLR2可导致肝损伤加重；BDL或慢性CCl4给予后，TLR2缺陷小鼠较野生型小鼠肝损伤降低；BDL后的TLR2缺陷小鼠细菌转位减少，内毒素水平下降，可通过减少TLR4信号途径减轻肝纤维化[34]。但也有研究指出，BDL后，在肝损伤和降低肝纤维化方面，TLR2缺陷小鼠与对照组无区别[35]。

TLR3信号是潜在的Ⅰ型干扰素诱导剂，唯一不依赖MyD88的TLRs，通过IRF激活干扰素信号通路。TLR3的天然配体是病毒双链RNA，合成的聚肌胞(Poly I∶C)也是TLR3信号的激动剂，Poly I∶C 可刺激肝NK细胞产生IFN-γ，诱导抗病毒、抗肿瘤及抗纤维化活性，Poly I∶C或IFN-γ可增强NK细胞的细胞毒性，刺激NK细胞杀死HSCs，减轻肝纤维化，该效应在早期肝纤维化可观察到[36]，但在进展期肝损伤，NK细胞/IFN-γ的抗纤维化效应受到抑制，原因可能在于活化HSCs产生更多的TGF-β和细胞信号抑制子1(SOCS1)[26,37]。Poly I∶C不能减轻酒精性肝病模型由CCl4诱导的肝纤维化，慢性酒精作用使依赖TLR3的NK细胞对HSCs的杀伤作用受到抑制，因此，在进展性肝病和酒精性肝病，肝纤维化加重的机制之一即TLR3介导的NK细胞活性降低[26]。

4 展 望

肝纤维化的发生是继发于肝脏炎症或细胞损伤后的修复反应，几乎所有的慢性肝脏损害的患者均可发生。随着研究地深入，人们逐渐认识到TLRs与肝纤维化的发生、发展密切相关，但是由于对其认识尚且不够全面，需要进一步探索TLRs对肝纤维化的作用机制，为肝纤维化日后的治疗提供更明确的思路。希望在不久的将来，TLRs成为治疗肝纤维化的新的药物干预靶标。

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四川省教育厅资助项目(12ZA039)。 作者简介：杨超(1990-)，硕士，主要从事中西医结合防治肝病的研究。△

，E-mail:1400124746@qq.com。

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2017-02-22

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