慢病毒载体介导HIF1α稳定表达A549细胞系构建*

邹 斌，周学亮#，詹宇亮，陈紫晴，赖松青，吴 霞，刘季春△

(南昌大学第一附属医院:1.心胸外科;2.心血管内科，南昌 330006)

慢病毒载体介导HIF1α稳定表达A549细胞系构建*

邹 斌1，周学亮1#，詹宇亮2，陈紫晴1，赖松青1，吴 霞1，刘季春1△

(南昌大学第一附属医院:1.心胸外科;2.心血管内科，南昌 330006)

目的 利用慢病毒载体系统构建稳定表达HIF1α的A549细胞系。方法 以NCBI人HIF1α基因编码序列为模板，设计并合成引物，PCR法扩增HIF1α。酶切回收的HIF1α片段与制备的慢病毒载体HBLV-RFP-Puro重组反应。PCR和基因测序鉴定重组质粒。重组质粒和辅助质粒共转染293T细胞。包装好的病毒经过滤、浓缩后，利用稀释计数法测定病毒滴度。制备好的慢病毒感染A549细胞，采用药物筛选稳定转染细胞系。荧光显微镜及Western blot检测观察转染及筛选效果。结果 PCR扩增HIF1α片段经鉴定成功，重组质粒经PCR、基因测序鉴定构建成功。成功包装获得高滴度LV-HIF1α。LV-HIF1α感染A549细胞后经药物筛选，荧光显微镜下细胞带有红色荧光，Western blot结果显示LV-HIF1α组HIF1α的表达水平明显高于对照组。结论 慢病毒载体介导HIF1α稳定表达的A549细胞系构建成功。

HIF1α；慢病毒载体；稳定表达；A549

肺癌是全球最常见的恶性肿瘤之一，其导致的死亡人数居各类恶性肿瘤之首[1]。在过去的研究中，尽管在肿瘤生物学、临床研究等方面取得了不断的进展，但肺癌的5年生存率仅提高了5%[2]。基于分子分型的个体化治疗及靶向治疗是肺癌治疗的发展方向之一。因此，肺癌的生物学研究聚焦于寻找关键驱动基因或信号通路。由于肿瘤缺氧激活的缺氧反应信号通路对肿瘤生物学行为(血管生成、侵袭、转移等)产生重要影响[3-4]。HIF1α是缺氧反应信号通路关键调控因子。临床研究发现，肺癌组织HIF1α的表达与淋巴结转移、分期、癌细胞分化等相关，肿瘤组织HIF1α阳性的肺癌患者5年生存率和总生存率明显低于阴性患者，HIF1α可能是具有潜质的预后生物标志物[5]。本研究基于慢病毒载体系统构建HIF1α慢病毒表达载体(LV-HIF1α)，筛选稳定表达HIF1α的A549细胞系，为深入探讨HIF1α在肺癌中的生物学作用建立基础。

1 材料与方法

1.1 材料 慢病毒包装系统(HBLV-RFP-Puro、pSPAX2、pMD2G)购于汉恒生物科技有限公司；A549细胞、293T细胞购于ATCC。大肠杆菌菌株DH5α购于Invitrogen公司；限制性内切酶购于Fermentas公司；琼脂糖凝胶回收试剂盒购于Axygen公司；一步式克隆试剂盒购于南京诺唯赞生物科技有限公司；质粒DNA大抽提取试剂盒购于Qiagen公司；LipofiterTM购于汉恒生物科技有限公司；嘌呤霉素(Puromycin)购于Sigma公司；mouse monoclonal to HIF1α Antibody购于Stan Cruz biotechnology公司；β-Actin Mouse Monoclonal Antibody 购于Cell signaling technology公司；HRP laaffinipure goat anti-Mouse IgG购于北京中杉金桥生物技术有限公司。PCR引物合成和目的基因测序由汉恒生物科技有限公司完成。

1.2 方法

1.2.1 重组慢病毒质粒pHBLV- HIF1α- RFP-Puro构建 根据NCBI人HIF1α基因编码序列设计引物，正向序列：5′-GGA TCT ATT TCC GGT GAA TTC GCC ACC ATG GAG GGC GCC GGC GG-3′，反向序列：5′-GGA TCC GCG GCC GCT TCT AGA GTT AAC TTG ATC CAA AG-3′，下划线序列为酶切位点。按试剂操作说明进行 PCR 扩增，50 μL反应体系，反应条件为:95℃，预变性5 min;94 ℃，20 s;55 ℃，20 s;72 ℃，2.5 min;25个循环;72 ℃，延伸10 min。1% 琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物。EcoRⅠ、XbaⅠ双酶切后回收目的片段。载体HBLV-RFP-Puro经双酶切后回收，处理好的目的片段和载体进行重组反应(37 ℃ 30 min)，后转化DH5α细胞，接种于含氨苄青霉素(100 μg/mL)的培养皿过夜，挑选单克隆菌落，摇菌后用菌液进行PCR鉴定，将阳性克隆菌液测序。软件对测序的克隆序列和基因库中的序列比对分析。

1.2.2 慢病毒包装及滴度测定 Qiagen试剂盒大量抽提制备好的慢病毒重组质粒及其辅助包装载体质粒，按LipofiterTM转染试剂说明，将重组慢病毒质粒pHBLV-HIF1α-RFP-Puro和辅助包装载体pSPAX2、pMD2G共转染293T细胞，转染后6 h更换为完全培养基，培养48 h和72 h后收集富含慢病毒颗粒的上清液，0.45 μm滤器过滤后离心浓缩病毒。稀释计数法测定LV-HIF1α滴度。病毒做3倍梯度稀释(连续6个稀释度)，准备6个1.5 mL EP管，第1管加入105 μL培养液及15 μL病毒原液，混匀后从第1个管吸取40 μL加入第2个管(含有80 μL培养液)，依次类推。稀释好的病毒液分别加入293T细胞，24 h后更换为含Puromycin(2.5 μg/mL)的培养液。因该慢病毒带有Puromycin抗性，通过感染后活细胞数目来判定滴度。显微镜下活细胞在10%～30%的孔计算病毒滴度。滴度(TU/mL)=细胞数×百分比×1(MOI)×病毒稀释倍数×103。

1.2.3 LV-HIF1α介导的A549稳定转染细胞系筛选 将状态良好的A549细胞接种于6孔板(5×105/孔)，分为LV-HIF1α组和慢病毒空载组(LV-RFP-Puro)并做好标记。培养 24 h 后至融合度达70%～80%，估计细胞数目，更换含慢病毒的培养液1 mL(含5 μg/mL Polybrene)，MOI取20，4 h补充另半量培养液1 mL(含5 μg/mL Polybrene),感染24 h后换完全培养基。利用该病毒携带有Puromycin抗性基因，采用药物筛选法筛选稳定转染细胞系。48 h后，更换含Puromycin(2 μg/mL)的完全培养液进行筛选。由于该病毒同时带有RFP基因，成功转染后的细胞将存活并表达红色荧光蛋白，在荧光显微镜观察到红色荧光。每隔2～3天换液、传代，反复筛选2周左右，未转染的细胞逐渐被筛除，带有红色荧光的细胞即为稳定转染的细胞。在此基础上，Western blot方法检测目的基因的表达，进一步验证转染、筛选是否成功。稳定表达目的基因的细胞系命名为A549-HIF1α，对照组命名为A549-RFP-Puro，待稳定转染细胞生长稳定后冻存细胞以备后续实验所需。

2 结 果

2.1 重组慢病毒质粒pHBLV-HIF1α-RFP-Puro成功构建 1%琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR扩增后的产物(图1)，大小与预期一致。扩增的目的基因片段及慢病毒载体经酶切回收，在适当的条件下重组反应，构建重组慢病毒质粒pHBLV-HIF1α-RFP-Puro。重组慢病毒质粒转化DH5α细胞，挑选单克隆菌落PCR鉴定，1%琼脂糖凝胶电泳可见与预计相符的特异性条带(图2)，由于PCR鉴定用的是载体上的一段通用引物，故比理论大小大400 bp左右。挑选阳性克隆菌液测序，测序的克隆序列和NCBI 数据库中基因序列比对分析，核苷酸序列完全一致。

Lane1:HIF1α PCR产物；Lane2:DNA Marker

图1 目的基因HIF1α PCR产物鉴定

Lane1:DNA Marker；Lane2～12:单克隆PCR产物

图2 pHBLV-HIF1α-RFP-Puro单克隆PCR产物鉴定

2.2 慢病毒包装、滴度测定 采用三质粒系统(pHBLV-HIF1α-RFP-Puro、pSPAX2和pMD2G)共转染293T细胞包装病毒，高效转染试剂盒提高转录效率。经过滤、浓缩后采用稀释计数法测定滴度。病毒做3倍梯度稀释，连续6个浓度，分别感染293T细胞，后加入Puromycin筛除未感染慢病毒的细胞，通过感染后活细胞数目来判定病毒滴度。如果某稀释度中有10个活细胞，那么说明该稀释度中至少含有10个病毒颗粒。显微镜下观察加入不同量的慢病毒存活细胞数目(图3)。LV-HIF1α组0.033 μL病毒孔细胞数目估计为4×104×10%左右，病毒稀释了30倍。滴度(TU/mL)=细胞数×10%×1(MOI)×病毒稀释倍数×103=1×108TU/mL。同样方法计算对照组LV-RFP-Puro病毒滴度。

2.3 LV-HIF1α介导的A549稳定转染细胞系成功构建 LV-HIF1α及LV-RFP-Puro分别感染A549细胞，利用载体同时带有RFP报告基因及Puromycin抗性基因的特点，采用Puromycin进行反复筛选。荧光显微镜观察，实验组和对照组细胞均带有红色荧光(图4)，获得目的基因稳定转染细胞系A549-HIF1α和阳性对照稳定转染细胞系A549-RFP-Puro。提取细胞总蛋白，Western blot检测两组细胞HIF1α的表达，结果显示LV-HIF1α组HIF1α的表达明显高于LV-RFP-Puro组(图5)，荧光显微镜及Western blot结果共同证实LV-HIF1α介导的A549细胞稳定转染细胞系构建成功。

图3 慢病毒载体滴度测定

A、B:荧光显微镜下观察到红色荧光；C、D：普通观察结果

图4 荧光显微镜下观察转染及筛选效果

图5 Western blot检测HIF1α的表达

3 讨 论

肿瘤细胞快速分裂、增殖而肿瘤内异常血管形成，这将导致肿瘤组织氧供需失衡。包括肺癌在内的许多实体肿瘤普遍存在缺氧的现象[6-8]。缺氧的肿瘤细胞将主要通过HIFs激活一系列的转录程序，如血管内皮生长因子、糖酵解酶、转化生长因子等，改变代谢，促进血管生成、侵袭、转移，并且影响肿瘤细胞对放化疗的敏感性[3]。临床研究发现，HIF1α与肺癌患者临床病理学和预后相关，HIF1α可能是具有潜质的预后生物标志物及治疗靶点[5-9]。近来研究发现，缺氧和HIFs可诱导肺腺癌细胞获得肿瘤干细胞特性[10-12]。然而，作为缺氧反应的关键调控因子，HIF1α在肿瘤干细胞中的作用及机制目前还不明了。因此本研究拟构建慢病毒载体介导HIF1α稳定表达的A549细胞系，为进一步研究HIF1α在肺癌干细胞中的作用及机制建立前期基础。

体外细胞缺氧模型通常采用缺氧或缺氧模拟物如二氯化钴来建立，虽然可以激活HIF1α信号通路，但其同时也激活了HIF2α，因此特异性较差。而且该缺氧细胞模型不适合用于体内肿瘤移植实验。慢病毒介导的外源基因转移具有高效、稳定、精准等特点，是目前细胞分子生物学研究常用的工具[13-14]。慢病毒可以将其携带的目的基因整合进宿主细胞基因组中，目的基因在细胞内长期稳定表达。慢病毒转染系统是构建稳定过表达或干扰细胞系的主要方式[15]。本研究涉及体内肿瘤移植实验，因此选择慢病毒载体系统构建HIF1α过表达载体，进一步筛选其介导的HIF1α稳定表达的A549细胞系。

该病毒同时携带有Puromycin抗性基因和RFP基因，利用该特点，采用药物筛选法筛选出稳定转染细胞系。未成功转染或非稳定表达的细胞对药物敏感，经反复药物筛选将逐渐筛除。成功转染并稳定表达的细胞在荧光显微镜下可以观察到红色荧光。经反复筛选，本研究观察到细胞形态无明显变化，70%～80%的细胞可见红色荧光，剩余细胞未见荧光或荧光较弱。这可能有以下2种情况：(1)本研究所选的筛选浓度可能非最佳筛选浓度，未成功转染的细胞产生了耐药；(2)成功转染的细胞活力受到影响，Puromycin抗性基因和RFP基因表达较弱，但对该浓度的Puromycin抵抗。笔者已采用较低病毒浓度转染细胞，以尽量减小病毒对细胞活力的影响。因此后续实验前有必要对细胞活力进行检测，通过荧光强度能间接反映目的基因的表达情况。Western blot结果显示LV-HIF1α组HIF1α表达明显高于LV-RFP-Puro组，进一步证实LV-HIF1α介导的A549稳定转染细胞系构建成功。

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Establishment of A549 cell line with stable expression of HIF1α mediated by lentiviral vector*

ZouBin1,ZhouXueliang1#,ZhanYuliang2,ChenZiqing1,LaiSongqing1,WuXia1,LiuJichun1△

(1.DepartmentofCardiothoracicSurgery;2.DepartmentofCardiology,FirstAffiliatedHospital,NanchangUniversity,Nanchang,Jiangxi330006,China)

Objective To establish the A549 cell line with stable expression of HIF1α by using lentiviral vector system.Methods Primers were designed and synthesized with human HIF1α gene coding sequence by the National Center of Biotechnogical Information(NCBI) as the template.HIF1α was amplified by PCR.The HIF1α fragment recycled by enzyme digestion was recombined with prepared lentiviral vector HBLV-RFP-Puro.The recombinant plasmid was identified by PCR and gene sequencing.The recombinant plasmid and the auxiliary plasmid were co-transfect into 293T cell.After filtration and concentration of packaged virus,the viral titer was detected by using the dilution counting method.The prepared lentivirus was infected A549 cells.The drug screening was adopted to stabilize the transfected cell line.The transfection effect was detected and observed by fluorescence microscope and Western blotting.Results The HIF1α fragment amplified by PCR was successfully verified and the recombinant plasmid was successfully constructed by PCR and gene sequencing identification.High-titer LV-HIF1α was obtained by successful package.After LV-HIF1α infecting A549 cells,the cells showed the red fluorescence by fluorescence microscope.The expression level of HIF1α in the LV-HIF1α group was significant higher than that in the control group by Western blot.Conclusion The 549 cell line with HIF1α stable expression mediated by lentivirus is constructed successfully．

HIF1α;lentivirrus;stable expression;A549

国家自然科学基金资助项目(81260024)。 作者简介：邹斌(1980-)，主治医师，博士，主要从事肺癌综合治疗研究。#共同第一作者:周学亮(1980-)，主治医师，博士，主要从事肺癌综合治疗研究。△

E-mail:liujichun999@163.com。

��·基础研究

10.3969/j.issn.1671-8348.2017.20.003

R734.2

A

1671-8348(2017)20-2744-03

2017-02-09

2017-04-14)