中晚秋“强桑1号”叶片生理生化变化的研究

林天宝，魏 佳，刘 岩，朱 燕，计东风，吕志强

（浙江省农科院 蚕桑所，浙江 杭州 310021）

中晚秋“强桑1号”叶片生理生化变化的研究

林天宝，魏 佳，刘 岩，朱 燕，计东风，吕志强＊

（浙江省农科院 蚕桑所，浙江 杭州 310021）

本研究以桑树品种“强桑1号”的叶片为试验材料，针对其叶绿素、可溶性蛋白、脯氨酸（PRO）、丙二醛（MDA）含量以及抗氧化酶等生理生化指标在中晚秋的变化，研究桑树在自然降温、桑叶逐渐老化过程中的生理特点。结果发现，“强桑1号”桑叶逐渐老化的过程中，叶绿素、可溶性蛋白含量降低，SOD、POD、CAT活性下降，脯氨酸和丙二醛的含量上升，抗氧化酶系统在桑叶的衰老过程中发挥了重要作用。

强桑1号；叶片；生理生化

桑树（Morus L.）是传统蚕桑产业的重要物质基础，桑树新品种“强桑1号”具有秋季产叶量高、叶质优、秋叶硬化迟的特点，它的秋叶硬化要比农桑14号晚20天左右［1］，这对提高晚秋蚕茧产质量具有重要意义。目前，对桑树叶片衰老的生理机制研究较少，本研究以“强桑1号”为材料，选取在其它植物叶片衰老中起重要作用的生理指标如叶绿素、可溶性蛋白、脯氨酸（PRO）、丙二醛（MDA）含量以及抗氧化酶等，研究其在桑树叶片衰老进程中的变化情况，以期能找出与桑树叶片衰老关联性较强的一些指标，为桑树育种提供参考依据。

1材料与方法

1.1试验材料

试验材料取自浙江省农科院蚕桑所内资源圃中保存的桑树品种“强桑1号”，6年生。每次试验取成熟叶第10片叶子（较嫩的上部叶）和第40片叶子（最大中部叶），“强桑1号”枝条共有80片叶子左右。

蛋白浓度检测试剂盒购于上海生工生物技术有限公司。脯氨酸（PRO）、丙二醛（MDA）、抗氧化酶CAT、POD和SOD活性检测试剂盒购于南京建成生物技术有限公司。Infinite M200酶标仪为瑞士TECAN公司产品。

1.2试验方法

2014年10月至11月，每隔15 d（10月5日，10月20日，11月5日，11月20日。）分别从5株桑树上取成熟叶第10片叶和第40片叶。进行叶绿素、游离脯氨酸（PRO）、可溶性蛋白质、丙二醛含量、过氧化氢酶（CAT）以及过氧化物酶（POD）和超氧化物歧化酶（SOD）活性的测定。

1.2.1叶绿素测定

取待测叶片0.1 g，加入10 ml 96%乙醇，室温放置于暗处48 h后，取出摇匀，用酶标仪于665 nm和649 nm处测定样品的吸光值。每个样品设三个重复，每个重复酶标仪检测时设置2个复孔，用下列公式计算叶绿素a（Ca）和叶绿素b（Cb）的含量，Ct为总含量。

1.2.2可溶性蛋白含量测定

叶片采摘后于液氮中研磨，取100 mg于离心管中，按照Bradford法蛋白浓度测定试剂盒（上海生工）说明书操作进行检测。每个样品设三个重复，每个重复酶标仪检测时设置2个复孔。

1.2.3PRO与MDA测定

叶片采摘后于液氮中速冻、研磨，取100 mg于离心管中，按照脯氨酸和丙二醛检测试剂盒说明，用比色法检测二者浓度。每个样品设三个重复，每个重复酶标仪检测时设置2个复孔。

1.2.4酶活性检测

称取1 g新鲜叶片，液氮研磨后加入9 ml生理盐水，冰上混匀，2500转离心10 min后取上清，分别检测CAT、SOD和POD活性，检测步骤分别参看南京建成CAT、SOD和POD检测试剂盒说明书。每个样品设三个重复，每个重复酶标仪检测时设置2个复孔。

1.2.5数据处理

采用SPSS 16.0软件单因素方差分析并进行多重比较；Excel计算回归方程和绘图分析。

2结果与分析

2.1中晚秋桑叶叶绿素含量的经时变化

由图1可知，从10月至11月，中部叶（第40片叶）与上部叶（第10片片）的叶绿素含量相对10月份分别下降了21.92%和25.05%，中部叶的叶绿素含量各月均高于上部叶的含量，中部叶叶绿素含量的平均值为3.287 mg/g，上部叶叶绿素含量的平均值为2.319 mg/g，二者相差0.968 mg/g，两者之间差异极显著（P＜0.01）。说明随着温度的降低，桑叶的老化，桑叶中叶绿素含量都呈逐月下降趋势，且下降明显。

图1 中晚秋桑叶叶绿素含量变化（mg/g）Figure 1 Changes of chlorophyll content(mg/g)

2.2中晚秋桑叶可溶性蛋白含量的经时变化

由图2可知，桑叶上部叶中的蛋白含量要高于同期中部叶，随着时间的推移，蛋白含量逐渐下降，上部叶中的蛋白含量下降明显，由最初的4.12 mg/g降低到2.86 mg/g，降低了30.8%，而中部叶中的蛋白含量则降幅较低，由2.93 mg/g降低到2.66 mg/g，降低了9.3%。说明可溶性蛋白含量与桑树叶片衰老呈负相关。

图2 中晚秋桑叶可溶性蛋白含量变化（mg/g）Figure 2 Changes of soluble protein content(mg/g)

2.3中晚秋桑叶PRO含量的经时变化

从图3中可以看出，中部叶中的PRO含量要高于上部叶，随着桑叶的老化，PRO含量急剧上升，中部叶由最初的627.95 μg/g上升到2057.58 μg/g，上部叶从551.68 μg/g上升到1828.08 μg/g，增幅都高达3倍以上，尤其是11月份，PRO含量增加越快。说明PRO含量与桑树叶片衰老呈正相关，桑叶越是老化，PRO含量越高，且变化明显。

图3 中晚秋桑叶PRO含量变化（μg/g）Figure 3 Changes of PRO content(μg/g)

2.4中晚秋桑叶MDA含量的经时变化

从图4中可以看出，中部叶中的MDA含量要高于上部叶，随着桑叶的老化，MDA含量上升，中部叶由最初的1.93 nmol/mgprot上升到2.64 nmol/mgprot，上升了36.8%，上部叶从1.57 nmol/mgprot上升到2.258 nmol/mgprot，上升了43.3%，尤其是越到后面，MDA的含量增加越快。说明MDA含量与桑树叶片衰老呈正相关，桑叶越是老化，MDA含量越高。

图4 中晚秋桑叶MDA含量变化（nmol/mgprot）Figure 4 changes of MDA content(mg/g)

2.5中晚秋桑叶CAT活力的经时变化

从图5中可以看出，中部叶中的CAT活力要高于上部叶，随着桑叶的老化，CAT活力下降，中部叶由最初的22.77 U/mgprot下降到13.17 U/mgprot，下降了42.2%，上部叶从17.23 U/mgprot下降到12.24 U/mgprot，下降了29.0%，尤其是随着桑叶的老化，CAT活力下降越快。说明CAT活力会随着桑叶的老叶而降低。

图5 中晚秋桑叶CAT活力变化（U/mgprot）Figure 5 Changes of CAT activity(U/mgprot)

2.6中晚秋桑叶POD活力的经时变化

从图6中可以看出，中部叶的POD活力由最初的879.65 U/mgprot下降到285.38 U/mgprot下降了67.6%，上部叶从729.24 U/mgpro下降到271.36 U/ mgprot，下降了62.8%，中部叶中的POD活力要高于上部叶。说明随着桑叶的老化，POD活力逐渐下降。

图6 中晚秋桑叶POD活力变化（U/mgprot）Figure 6 Changes of POD activity(U/mgprot)

2.7中晚秋桑叶SOD活力的经时变化

从图7中可以看出，中部叶的SOD活力由最初的8.51 U/mgprot下降到4.60 U/mgprot，下降了46.0%，上部叶从7.68 U/mgpro下降到2.51 U/mgprot，下降了67.4%，说明中部叶中的SOD活力要高于上部叶，而且随着桑叶的老化，SOD活力下降明显。

图7 中晚秋桑叶SOD活力变化（U/mgprot）Figure 7 Changes of SOD activity(U/mgprot)

3讨论

桑叶在硬化过程中，生理生化代谢均会发生变化，本实验以桑树品种“强桑1号”在中晚秋不同部位、不同时期的叶片为研究材料，研究在桑叶硬化过程中生理指标的变化动态，结果表明，桑叶中叶绿素含量呈下降趋势，且下降明显。许多研究表明，叶片衰老期间，叶绿体的大小数目均减少［2］，叶绿素含量和衰老之间存在明显的负相关［3］，这与本实验结果相符。

蛋白质降解是叶片衰老的基本特征［4］，强桑1号上部叶中的蛋白含量要高于同期中部叶，随着时间的推移，上部叶与中部叶中蛋白含量都逐渐下降，上部叶中的蛋白含量下降明显，这可能是植物在衰老过程中，各种蛋白质水解反应显著增加，蛋白质水解酶的数量和活性增加［5，6］。

植物生育后期体内许多需氧代谢过程产生的活性氧增加，活性氧清除剂减少，使活性氧不能被及时清除，造成对细胞及组织的损害，是导致叶片衰老加速的重要原因［7，8］，因此，很多研究都将SOD、POD、CAT的含量作为研究衰老的指标。本实验中，中部叶中的SOD、POD、CAT活性都比上部叶中的高，且都随着时间的推移而降低，SOD、POD的降幅均较大，说明抗氧化酶系统在桑叶的衰老过程中发挥了重要作用。

MDA是一种强烈地与细胞内其他成分发生氧化反应的物质，因而易引起对酶和膜的严重损伤，导致膜结构完整性及生理功能的破坏［9］，是反映膜质过氧化程度的重要指标，在衰老的过程中不断积累，其积累来自不饱和脂肪酸的降解［10］，本实验中中部叶中的MDA含量要要高于上部叶，随着桑叶的老化，MDA含量上升，越到后期，MDA的含量增加越快。

PRO是一种重要的渗透调节物质，当植物处于低温、干旱及重金属污染等逆境条件时，游离脯氨酸在植物体内积累，而且积累的量与植物的耐胁迫能力正相关［11］，在本实验中，中部叶中的PRO含量要高于上部叶，随着桑叶的老化，PRO含量急剧上升，增幅都高达3倍以上，尤其是越到后期，PRO的含量增加越快。

综上所述，强桑1号叶片在自然降温、桑叶逐渐老化的过程中，叶绿素、可溶性蛋白含量降低，PRO和MDA的含量上升，SOD、POD、CAT活性下降。其中PRO与POD、SOD的指标变化非常显著，可作为桑树叶片衰老的重要判定指标，为桑树育种提供一定的参考依据。

［1］ 吕志强，计东风，周勤，等.桑树新品种强桑1号的选育［J］.蚕业科学，2011，37（1）：9-12.

［2］HASHIMOTO H，KURA-HOTTA M，KATOH S，et al. Changes in protein content and in the structure and num⁃ber of chloroplasts during leaf senescence in rice seedling［J］.Plant Cell Physiol，1989，30（5）：707-715.

［3］MARTIN C，THIMANN K V.The role of protein synthe⁃sis in the senescence of leaves［J］.Plant physiology，1972，49（1）：64-71.

［4］ 吴光南，刘宝仁，张金渝.水稻叶片蛋白水解酶的某些理化及其与衰老的关系［J］.江苏农业学报，1985，1（1）：1-8.

［5］NOODEN L D，GUIAMET J J，JOHN I.Senescence mechanisms［J］.Physiol Planta，1997，101（4）：746-753.

［6］BELKNAP W R，GARBARINO J E.The role of ubiqui⁃tin in plant senescence and stress response［J］.Trends Plant Sci，1996，1（10）：331-335.

［7］ 林植芳，李双顺，林桂珠，等.水稻叶片的衰老与超氧化物歧化酶活性及脂质过氧化作用的关系［J］.植物学报，1984，26（6）：605-615.

［8］ 曹显祖，朱床森，顾自奋.杂交水稻结实率的研究［J］.中国农业科学，1980，13（2）：44-46.

［9］HALLIWELL B，CHLOROP M.The structure and func⁃tion of chloroplasts in green leaf cells［M］.Oxford：Clar⁃endon Press，1981，186.

［10］段咏新，李松泉，傅家瑞.钙对延缓杂交水稻叶片衰老的作用机理［J］.杂交水稻，1997，12（6）：23-25.

［11］鞠志新.东北地区牡丹适应性及抗寒性研究［D］.北京：北京林业大学，2011：71-85.

Study on the Changes of Physiological and Biochemical Indexes of‘Qiangsang 1’in Mid and Late Autumn

LIN Tian-bao,WEI Jia,LIU Yan,ZHU Yan,JI Dong-feng,LV Zhi-qiang＊
（Sericulture Research Institute,Zhejiang Academy of Agricultural Sciences,Hangzhou 310021,China）

In order to study the physiological characteristics changes of mulberry leaves during the natural cooling and aging,the leaves of mulberry variety‘Qiangsang 1’were used as experimental material,the physiological and biochemical indexes such as chlorophyll,soluble protein,proline,MDA and antioxidant enzyme were observed.The results show that the content of chlorophyll and soluble protein were decreased,the activity of antioxidant enzymes SOD, POD and CAT were also decreased,while the level of proline and MDA were increased in mulberry leaves during the natural cooling and aging.These results suggest that the antioxidant system plays an important role in the aging process of mulberry leaves.

Qiangsang 1;mulberry leaves;physiological and biochemical

S888.31

A

0258-4069［2017］01-014-04

浙江省农业（畜禽）新品种选育重大科技专项（2016C02054）；浙江省蚕桑产业科技创新团队（2011R50028）

林天宝（1982-），男，浙江平阳人，助理研究员，大学本科，主要从事桑树遗传育种研究。E-mail：kissumbra@126.com

吕志强，男，研究员。E-mail：13958131715@139.com