狗枣猕猴桃离体培养和快速繁殖研究

吕海燕 赵婷婷 钟彩虹

摘要[目的]研究狗枣猕猴桃离体培养和快速繁殖技术。[方法]以狗枣猕猴桃幼嫩带芽茎段、幼嫩叶片及叶柄作为外植体，研究其组织培养整个过程，建立快速高效的狗枣猕猴桃快繁体系。[结果]器官发生途径最适宜的外植体为幼嫩叶片。

筛选出最适宜腋芽一步成苗的培养基配方为MS+1.25 mg/L 6-BA+0.250 mg/L NAA，腋芽萌发率达92.90%，通过对无菌苗进行生根诱导试验，筛选出最佳生根培养基为1/2MS + 0.2 mg/L NAA，生根率100%，平均根数12.5条。[结论]该研究为狗枣猕猴桃产业化生产及优良种质资源的保存工作提供了理论和技术支撑。

关键词狗枣；离体培养；快速繁殖

中图分类号S663.4文献标识码A文章编号0517-6611（2017）17-0116-03

Abstract[Objective]To study culturing in vitro and rapid regeneration of Actinidia kolomikta.[Method]A stable and efficient in vitro rapid propagation system of A. kolomikta was established by using the stem segments with axillary buds，petioles and leaves as explants.[Result] Leaves were the best explants for callus induction of A. kolomikta.The best onestep culturing medium for stem segments with axillary buds was MS+1.25 mg/L 6BA + 0.250 mg/L NAA，the axillary bud germination rate was 92.90%.The adventitious shoots were cultured in the same medium， then transferred to the MS supplemented with 0.2 mg/L NAA. The rate of adventitious root regeneration and the average number of roots were 100% and 12.5， respectively.[Conclusion]The research provided theoretical and technical support for the conservation and industrialization of A.kolomikta excellent germplasm resources.

Key wordsActinidia kolomikta；Culture in vitro ；Rapid regeneration

基金项目2016年湖北省技术創新专项（重大项目）（2016ABA109）；中国科学院科技服务网络计划（KFJ-EW-STS-076）；国家自然科学基金青年基金项目（31101520）。

作者简介吕海燕（1983—），女，湖北武汉人，工程师，硕士，从事猕猴桃组织培养技术研究。*通讯作者，研究员，博士，从事猕猴桃育种、种质资源及种植技术等研究。

收稿日期2017-04-21

狗枣猕猴桃（Actinidia kolomikta）属猕猴桃科猕猴桃属小型落叶藤本，果实可食用、酿酒及入药，维生素C含量高，是很好的药食同源植物[1]。

国内狗枣猕猴桃主要分布在东北3省（海拔500～800 m）、四川（海拔1 600～2 900 m）山地混交林或杂木林中开旷地[2]。因其独特的生态习性，在华中地区的引种栽培中，常规育种繁殖方法如高接、扦插、播种繁殖成活率较低，植株生长势弱，结果少，而利用组织培养离体保存该种质资源意义重大。笔者对狗枣猕猴桃的组织培养进行研究，探讨其离体培养保存方法和快速繁育技术，为其产业化生产及优良种质资源的保存工作提供理论和技术支撑。

1材料与方法

1.1材料

2015年3—11月、2016年3月，以国家猕猴桃种质资源圃（中国科学院武汉植物园内）保存的狗枣猕猴桃为试材，取带腋芽茎段、幼嫩叶片、叶柄，自来水冲洗1 h，在超净工作台上用75%乙醇浸泡45 s，0.1%升汞中浸泡10 min，无菌水冲洗4 ～ 5次，于无菌滤纸上晾干待用。

1.2方法

1.2.1不同外植体离体再生试验。

消毒好的外植体，带腋芽茎段每含1 ～ 2个腋芽切成1段，叶片切成0.5 cm×0.5 cm大小，叶柄切成0.5 cm长小段，接种于含不同浓度6-BA、ZT、NAA的MS培养基中，6-BA质量浓度为2000、1000、0 mg/L，NAA质量浓度为0.100、0.200、0.400 mg/L，ZT質量浓度为0、1.000、2.000 mg/L，采用L9（4）3正交表进行试验设计，共计9个处理，每个处理15个外植体，各3次重复，接种后置于光培养室光下培养8～14 d调查腋芽及愈伤萌发率。

1.2.2不同采样时间狗枣腋芽离体萌发试验。

于2015年3月、5月、6月、11月分4次对狗枣嫩枝采样，进行带腋芽茎段的萌发诱导试验，材料消毒方法同“1.1”，所用培养基配方为MS+6-BA 1.000 mg/L+NAA 0.200 mg/L，每个月份分3次取样作为3个重复，每个重复30个外植体，21 d后统计腋芽萌发率。

1.2.3不同浓度激素配比诱导狗枣一步成苗。

于2016年3月采狗枣幼嫩茎段，外植体消毒处理后，接入含不同浓度6-BA和NAA的MS培养基中，6-BA质量浓度0.750、1000、1250、1.500 mg/L，NAA质量浓度为0.125、0.250、0500、1.000 mg/L。随机处理组合，共16个处理，各3次重复，每个重复15个外植体，28 d后观察统计再生率。无菌苗于最佳诱导培养基上继代，统计增殖系数。

1.2.4不定芽的生根。

将生长状态良好的狗枣无菌苗切成含2 ～ 3片叶片的小段，形态学下端朝下分别接种到附加有不同质量浓度NAA（0、0.200、0.500、1.000 mg/L）的1/2MS培養基上进行生根培养，每处理重复3次，每个重复15个节段，培养21 d后，统计生根率和生根数量。

该试验光培养条件为12h/d光照，光照强度2 500 lx，温度（25±2）℃，MS基本培养基添加蔗糖30 g/L、琼脂8 g/L，pH 6.0。

1.3数据分析

采用SPSS 20.0数据分析软件处理数据，进行方差分析。

愈伤再生率=再生愈伤叶片数（叶柄数）/接种外植体总数×100%

腋芽萌发率=萌发外植体数/接种外植体总数×100%

生根率=生根芽数/接种芽数量×100%

2结果分析

2.1不同处理对外植体萌发的影响

外植体接种7 d后，带腋芽茎段在附加1.000 mg/L 6-BA和0.200 mg/L NAA的MS培养基中即可萌发腋芽，且萌发率显著高于其他处理（图1）。叶片、叶柄均有不同程度的愈伤组织再生，但愈伤分化缓慢，叶片再生的愈伤组织有少量不定芽再生，但多发育为白化苗（图2）。方差分析结果表明，试验中的4个因素各水平之间差异显著，结合萌发率的直观分析和正交设计的优选原则，可得出因素6-BA中2.000 mg/L水平，ZT中2.000 mg/L水平，NAA中0.400 mg/L的水平，外植体选择带腋芽茎段时效果最好。即最佳组合为选择带腋芽茎段为外植体，添加2.000 mg/L 6-BA、2.000 mg/L ZT和0.400 mg/L NAA的培养基最适合狗枣的离体萌发（表1）。

2.2不同采样时间对腋芽萌发的影响

由表2可知，3月份为外植体采样的最佳时间，此时外植体生长状态良好，再生能力强，不易褐化。随着时间往后推移，外植体再生能力降低，且很容易褐化死亡。

2.3不同浓度的6-BA和NAA组合对狗枣一步成苗的影响

根据“2.1”的试验结果，对带腋芽茎段进行一步成苗诱导试验。结果分析表明，低浓度的6-BA培养基诱导下外植体形成少量愈伤，但愈伤组织灰白色，易碎，不易分化，随着6-BA浓度的增加，外植体愈伤化愈加严重（图3），严重滞缓了茎段上腋芽的萌发影响了一步成苗的效率。由表3可知，当6-BA浓度为1.250 mg/L，NAA浓度为0.250 mg/L时，接种7 d即可见腋芽萌发，且迅速抽长，生长健壮。将萌发的腋芽切下置于相同的培养基上培养，无菌苗生长迅速，增殖快，通过茎段扩繁，30 d的增殖系数可达4～5。确定MS+6-BA 1.250 mg/L+NAA 0.250 mg/L为狗枣一步成苗最佳培养基配方。

2.4不同浓度的NAA对不定芽生根的影响

狗枣猕猴桃易生根，即使在不添加任何激素的1/2MS上也能生根（图4），但耗时长，21 d左右才出现可见根（表4），随着NAA浓度的增加，植株基部愈伤化（图5），影响生根进程，当NAA浓度为0.200 mg/L时，生根数量最多，每棵植株可再生出12.5条根，生根快，且基部无愈伤组织（图6）。

3讨论

猕猴桃离体再生可供选择的外植体很多，大量研究证实

猕猴桃茎段、叶片、叶柄、花瓣、花粉、胚乳等均可作为有效外植体进行再生诱导试验[3-7]，该试验着眼于狗枣猕猴桃一步成苗快繁技术的研究，采用带腋芽茎段作为外植体，减少再生分化的细胞再生过程，能极大地加快产业化育种进程。

培养基中激素的种类和比例是猕猴桃组织培养研究成功的关键[8-10]。很多学者指出，ZT对猕猴桃愈伤组织和不定芽的分化有很好的诱导效果[5，11]，该试验中6-BA和NAA适宜浓度组合对狗枣离体快繁的效果不亚于ZT组合，从实际生产成本来讲，6-BA对ZT的取代，很大程度上降低了产业化种苗的生产成本。

参考文献

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