红颜草莓的离体培养与快速繁殖

摘要：以红颜草莓的茎尖作为外植体，研究了外植体的消毒方法、激素组合对其离体培养与快速繁殖的影响。结果表明，幼茎段在0.1%氯化汞+3滴吐温-80溶液中浸泡5 min灭菌效果最好；茎尖以0.35 mm大小为宜；诱导丛生芽的最适培养基为：MS+0.5 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA；诱导试管苗生根的最适培养基为：1/2MS+0.1 mg/L IBA。

关键词：草莓；离体培养；不定芽；快速繁殖

中图分类号： S668.404+.3文献标志码： A文章编号：1002-1302（2015）11-0066-03

收稿日期：2015-04-14

基金项目：2014年江苏省农业三新工程（编号：SXGC[2014]141）。

作者简介：李慧（1971—），女，江苏宿迁人，硕士，教授，主要从事园艺作物的组织培养研究。E-mail：lihui710623@163.com。红颜又称日本99、红颊，是日本静冈县用章姬与幸香杂交育成的早熟草莓栽培品种。叶片大、新茎分枝多，结果能力强，果实品质好，果粒个大，果形、果色、价格明显优于丰香草莓。是春节前后集采摘、鲜食为一体的休闲旅游消费农产品，深受广大果农和顾客的喜爱。但是，红颜草莓苗不抗白粉病，不易育苗，幼苗一旦染病，几天内将全军覆没。因此，试管苗的繁育将有很大的市场前景。

1材料与方法

1.1材料

试验于2014年12月至2015年4月进行。供试材料红颜草莓苗引自淮安怡园果蔬种植专业合作社（实生苗2014年9月栽植在江苏联合职业技术学院淮安生物工程分院花卉实训中心的无土栽培槽内）。

1.2试验方法

1.2.1表面灭菌试验于晴天的下午取供试红颜草莓刚抽出的匍匐茎的幼茎段（母株要健壮、无病），流水冲洗泥土、灰尘。在无菌条件下，先用75%乙醇浸泡20～30 s，无菌水冲洗3～4次，再转入0.1%氯化汞溶液+2滴吐温-80分别浸泡8、5、4、2 min，无菌水冲洗5～8次。在以上的过程中要不断摇动，以去除附在外植体表面的气泡。用消毒滤纸吸干水珠后，将茎尖接种于诱导培养基中，调整pH值至5.6～5.8。每个灭菌处理各接种50瓶，1个外植体/瓶，20 d后观察记录外植体的污染、死亡、无菌成活生长等情况。

1.2.2茎尖分化能力试验取“1.2.1”节试验最佳处理，在双目显微解剖镜下剥去苞片和幼叶，将茎尖接种于MS+0.5 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA培养基中[1]。接种外植体1个/瓶，30 d后观察记录茎尖分化情况。

1.2.3芽诱导试验取“1.2.2”节试验中最佳的茎尖剥制处理分别接种于以0.5 mg/L 6-BA为基础的附加不同种类生长素（0.2 mg/L）配成的培养基、以0.2 mg/L NAA为基础的附加不同种类生长素及细胞分裂素（0.5 mg/L）配成的培养基中[2]，每个处理各接种30瓶，1个外植体/瓶，30 d后开始调查记录幼芽分化情况。

1.2.4继代培养与扩大繁殖将长至1～2 cm的丛生芽每4～6株切成1块，转入不同浓度配比的6-BA和NAA配成的继代培养基中。每种处理接种20瓶，4块/瓶，培养20 d后统计每瓶幼苗数量，并计算出增殖率。

1.2.5根诱导试验用1/2MS附加不同浓度（mg/L）IBA，有0.05、0.10、0.20、0.50 mg/L及不加IBA的5个处理，接入幼苗3周后观察记录根的生长情况。

培养基均加3%蔗糖，在1.0～1.1大气压下热压灭菌20 min。培养温度（25±2） ℃。每日光照12 h，光照度2 000 lx 。

2结果与分析

2.1不同消毒剂对红颜幼茎灭菌的效果

在草莓组织培养中常用灭菌剂的种类很多。我们曾用过次氯酸钠10%水溶液（含有效氯0.4%～0.5%），浸泡接种材料10～15 min；次氯酸钙（漂白粉），用其饱和上清液，浸泡接种材料15～30 min；过氧化氢10%～12%水溶液，浸泡10～20 min ；新洁尔灭5%～10%水溶液，浸泡10～15 min；氯化汞0.1%水溶液，浸泡8～10 min。其中，前4种灭菌剂对接种材料比较安全，不会使活组织中毒死亡，但因灭菌时间较长，常常使接种材料的外层氧化变褐，影响培养效果。氯化汞有很强的杀菌能力，但浸泡时间稍长会造成接种材料中毒。即使在氯化汞处理完后，用无菌水冲洗7～8次，仍然有少量残留在外植体上，导致外植体死亡。

用0.1%氯化汞溶液浸泡处理5 min，外植体染菌率为0，成活率为78%；4 min浸泡茎段，外植体总染菌率为18%，死亡7个；当茎段浸泡2 min后，外植体死亡数为3个，但总染菌率高达56%（表1）。

观察中发现4种处理外植体在接种1周内都有不同程度褐化现象并导致生长缓慢，10 d后成活的外植体褐化现象消失（图1、图2）。这可能是因为使用乙醇进行表面消毒时，乙醇毒害所致。

2.2不同大小的茎尖对形态发生能力的影响

剥制后的红颜茎尖接种在芽诱导培养基中，7 d后开始膨大，并在外植体表面产生愈伤组织，20 d后部分愈伤组织上可形成幼芽。从表2可以看出，小于或等于0.1 mm的茎尖，无形态发生能力；当茎尖达0.2 mm时，只有有限的生长；茎尖大小达0.35 mm，带有最后1对较大的叶原基，而没有顶端下组织时，茎尖的分化率最高；如果切取0.5 mm的茎尖，发现茎尖直接形成单株苗，形成愈伤组织的百分率显著下降。

2.4不同浓度6-BA和NAA对幼苗增殖的影响

增殖培养基的筛选中，附加6-BA 0.5 mg/L分化反应正常，虽然在相同的时间里新芽分化量相对较少，而长成正常幼苗的数量却明显较多。当6-BA浓度超过1.0 mg/L时，新芽分化量很大，也都能长出叶片，只是叶片簇生在一起成球状，不能长成正常幼苗（表5）。从表5可以看出，2号培养基对幼苗增殖的生长分化最为有利。

此外，转苗过程中去掉原生叶片有利于新苗分化，在扩大繁殖中剔除愈伤组织，有利于新苗增殖和生长。

2.5不同浓度IBA对试管苗生根的影响

从表6可以看出，以IBA 0.1 mg/L浓度处理的生根率最高，为100%，平均根条数为2.3条。不加IBA及IBA超过02 mg/L，多数苗都是先于苗基切口处产生愈伤组织，随后在愈伤组织上分化生根。当生根苗移出栽植后，苗基的愈伤组织很快干死，使苗与根间形成了1个隔离层，成活率大大降低。

3讨论

本试验以红颜草莓为供试材料，研究其茎尖经脱分化后多数为愈伤组织上生根 0.50愈伤组织上生根 注：不同处理参试苗为150个，培养3周后统计结果。

诱导不定芽发生的因子，旨在提高草莓不定芽发生率。在植物离体形态发生中，影响器官分化的因素很多，但以植物激素的调控为主[3-6]。不同植物种类，控制其不定芽发生的植物生长调节剂的种类、浓度以及它们之间的组合不同，本试验中为BA与NAA的不同浓度组合。从不定芽发生的动态观察中可知，不定芽发生高峰期集中在接种后20～40 d的时间段内，50 d以后再生的不定芽，其芽体弱小，生长速度慢。这可能是由于随着时间的延长，培养基营养消耗大；同时，外植体自身分泌物的积累限制了不定芽的分化及生长，也可能与愈伤组织内某些生理生化物质的积累有关。

参考文献：

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