基于原球茎液体培养的白芨快速繁殖研究

张宇思+姚正颖+刘金香+张卫明+丁小余+孙力军

摘要：为了建立高效的白芨快繁技术体系，研究了白芨种子萌发和原球茎生长的液体培养条件，比较了全程固体培养基培养（QG）与液体固体培养基分段培养（YG）这2种培养方式的优劣。首先通过L18（37） 正交试验，筛选了适宜种子萌发及原球茎生长的液体培养条件。结果表明，添加剂种类、大量元素、6-BA浓度、NAA浓度对白芨种子萌发及原球茎诱导影响最大。统计分析结果表明，最佳培养条件为1/4MS+1 mg/L NAA + 0.5 mg/L 6-BA +100 g/L马铃薯汁+30 g/L蔗糖，pH值 5.8，培养温度为22 ℃，摇床转数为100 r/min，每天光照时间为8 h。另外，源于YG的白芨苗在移栽成活率、叶片颜色、叶片长度、苗高几个方面均优于源于QG的白芨苗，且差异显著。本研究创建的液体固体培养基分段培养体系将有助于保护与可持续利用白芨野生资源。

关键词：白芨；快速繁殖；分段培养；全程固体培养基；液体固体培养基

中图分类号： S567.23+9.043 文献标志码： A 文章编号：1002-1302（2015）10-0059-04

白芨[Bletilla striata （Thunb.） Reichb. f.]为兰科白芨属多年生草本植物，以块茎供药用，其种子极小，结构简单且无胚乳，自然繁殖率极低[1]。近年来，白芨的应用范围逐步扩大，加上市场需求的快速增长，野生资源遭到过度采挖，已濒临灭绝，现已被列为国家重点保护野生植物[2]。为了保护白芨野生资源，实现白芨的人工种植，逐渐有一些关于白芨组培快繁的研究，这些研究为白芨野生资源的保护与利用提供了参考。目前，虽然白芨组织培养和设施栽培等人工繁育关键技术得到了一定的发展，但是依然面临着种苗培养周期长、成本高等问题。为了最大限度地缩短白芨快繁的时间，降低成本，提高白芨种苗的质量，仍需探索更好的白芨快繁条件。

目前白芨的常规快繁方法大多以固体培养基为主，即将白芨种子播于固体培养基上，经过原球茎、无根苗、有根苗等几个阶段，最终获得可移植到大田的白芨苗[3]。但是，利用固体培养基快繁白芨苗时，从组培瓶取出操作较费工费时，且白芨种子及原球茎在固体培养基上生长较慢，繁殖效率很低。为了保护与可持续利用白芨野生资源，本试验针对单纯采用固体培养基的快繁技术的不足，研究利用白芨种子进行液体和固体培养结合的快繁方式，以期缩短白芨快速繁殖周期，建立一种新的白芨快速繁殖体系。

1 材料与方法

1.1 材料

白芨蒴果来源于安徽省宿松县，秋分节气前后采收，果荚饱满，开裂或未开裂，外表无霉变，颜色为黄绿色与褐色相间，内部种子呈分散状。

1.2 白芨快繁操作方法

试验过程包括白芨种子的灭菌、原球茎诱导培养、增殖培养、壮苗培养、生根培养5个步骤，具体方法如下：

1.2.1 灭菌 对于未开裂果荚，在超净台中用75%乙醇将白芨蒴果消毒30 s，再用0.1%HgCl2水溶液浸泡25 min，无菌水冲洗5次，然后置于干燥的灭菌滤纸上吸尽水分，用解剖刀切开蒴果，取出种子；对于开裂果荚，在超净台中，将种子取出，置于两通玻璃管中，玻璃管一端用纱布和脱脂棉封口，并用75%乙醇和1%次氯酸钠溶液各消毒30 s和15 min，再用灭菌水灌洗3 min，最后剪开纱布，收集灭菌的种子。为了避免种子因蒴果来源不一致造成较大误差，2种方式收集的灭菌种子合二为一。为了便于统计，将得到的种子用以下方式定量与接种：用灭菌水悬浮种子，种子浓度约为100粒/50 μL，用移液枪吸取种子，播于液体培养基中，每瓶接种 300 μL。对于固体培养基，用同样的方法接种，为了让种子在琼脂培养基上分散，在接种后多加200 μL灭菌水，以便冲散可能聚集的种子。

1.2.2 原球茎在液体培养基中的诱导培养 将种子接种到液体培养基中，诱导原球茎生长。设计L18（37）正交试验，对液体培养基配方中的7个因素，包括大量元素浓度、NAA浓度、6-BA浓度、添加剂种类、培养温度、摇床转数、光照时间等进行培养条件筛选。筛选试验的因素水平见表1。其中，添加剂含量为100 g/L，光照度为2 500 lx。将白芨种子接种各配方培养基后，跟踪观察种子萌发时间，测定原球茎生长速度。规定20%种子萌发（吐绿）作为萌发时间的记录点。接种20 d后（每种处理的种子萌发率均已达97%以上），随机选取50粒原球茎，测定其直径。因为用水稀释法接种的种子数并不完全一致，因此，随机选取500粒已测直径的原球茎，在65 ℃环境中烘干，称干质量。呈现的数据为3次独立试验的平均值；测量原球茎直径时，对于每个处理，所取原球茎数量大于50粒。

1.2.3 分化培养 将各配方培养所得的原球茎（包括来源于固体培养基的原球茎）转移到分化培养基上，温度25 ℃，相对湿度55%～75%，光照度2500 lx，光照周期为10 h/14 h，进行分化培养。随后将温度调整为夜温22 ℃，日温25 ℃，进行壮苗培养。

1.2.4 生根培养 将白芨小苗从壮苗培养基转入生根培养基，诱导根的分化。培养条件为夜温22 ℃，日温25 ℃，相对湿度55%～75%，光照度3000 lx，每天光照10 h。然后将快繁苗置于遮阴度为80%的大棚中，在瓶中培养3 d后打开瓶盖，再培养3 d，小心取出白芨苗，洗净根上黏附的琼脂，移栽至配好的基质中。培养1个月以后，观察生长状况。

1.3 结果统计

记录白芨种子萌发时间，利用游标卡尺测量原球茎的直径，称量原球茎干质量，并对原球茎的直观生长状况进行描述。利用SPSS 13.0对每次试验结果进行数据分析。

2 结果与分析

2.1 4个主要因素对种子萌发时间与原球茎生长速度的影响

本试验规定，20%种子萌发即为种子萌发时间记录点。从图1可以看出，萌发的种子呈现浅绿色。随着萌发种子数量的增多，原球茎已形成。20 d后，迅速生长中的原球茎已呈现深绿色。根据白芨及兰科其他植物种子培养条件的相关文献，选择大量元素浓度、NAA浓度、6-BA浓度、添加剂种类、培养温度、摇床转数、光照时间等7个因素作为筛选培养条件的考察对象，正交试验方案及结果见表2。18号处理组的种子1周后便开始萌发，而3号和10号处理在12 d左右时才开始萌发。与此对应的是，18号处理组的原球茎直径为 2.69 mm，且颜色均一，呈现浓绿色（图2-A）；3号（图2-D）和10号处理的原球茎直径仅为1.11 mm和1.23 mm，颜色不均一，许多呈现浅黄色。同时，18号处理的500粒原球茎干质量约0.522 g，而11号和10号处理的原球茎干质量仅为0.090 g和0.095 g（3号为0.099 g）。1号（图2-C）和16号（图2-B）原球茎直径相当，分别为1.60 mm和1.61 mm，颜色也较均一，优于3号，劣于18号。

对白芨种子萌发时间数据作极差分析，结果（表3）显示，7个因素的极差值分别为2.283、0.916、0.633、2.284、0.500、0.617、0.300 d。其中大量元素、添加剂种类极差值较大。由于影响因素不同水平的极差大小与该因素对试验结果的影响程度呈正相关，因此由极差可以推断，对种子萌发影响的主次程度为添加剂种类>大量元素>NAA浓度>6-BA浓度>摇床转数>温度>光照时间。对原球茎直径数据作极差分析，结果表明，4个因素的极差较大，分别为0.600、0.266、

0.324 、0.526 mm，可推测对原球茎直径影响的主次程度为大量元素>添加剂种类>6-BA浓度>NAA浓度。然而，对500粒原球茎干质量的数据分析显示，影响因素主次程度却为添加剂种类>大量元素>NAA浓度>6-BA浓度（极差分别为0179、0.131、0.091、0.080 g）。

对种子萌发时间、原球茎直径、原球茎干质量的数据作方差分析（表4）可知，添加剂种类、大量元素对种子萌发时间、原球茎直径、干质量的影响达到显著水平（P<0.05），与极差分析结果一致。值得注意的是，添加剂种类、大量元素对原球茎直径的影响达到极显著水平（P<001），添加剂种类对原球茎干质量的影响达到极显著水平（P<0.01）。

综上所述，在本试验中预选的7个影响因素中，添加剂种类、大量元素对白芨种子萌发及原球茎诱导影响最大，其次为6-BA浓度、NAA浓度。以上述数据为基础可推测，在本研究中，白芨种子萌发及原球茎诱导最佳培养基为液体1/4MS+

1 mg/L NAA+0.5 mg/L 6-BA+100 g/L马铃薯汁+30 g/L 蔗糖，pH值5.8，培养温度为22 ℃，摇床转数为 100 r/min，每天光照时间为8 h。

2.2 2种培养方法对白芨快繁苗质量的影响

液体固体培养基分段培养（YG）即是原球茎阶段在液体培养基中进行，从原球茎分化到生根过程则在固体培养基上进行；而全程固体培养基培养（QG）则是整个过程均在固体培养基上培养，培养时间、培养基配方、后续移栽炼苗过程均与分段培养一致。2种培养方法种子萌发及原球茎诱导的培养条件均为液体1/4MS+ 1 mg/L NAA+0.5 mg/L 6-BA+100 g/L马铃薯汁+30 g/L蔗糖，pH值5.8，培养温度为 22 ℃，每天光照时间为8 h。结果表明，2种方法培养的白芨苗在移栽1个月后的生长状况差异明显。源于YG的白芨苗移栽成活率为98.33%，而源于QG的成活率仅为80.53%，差异显著（P<0.05，表5）。

3 结论与讨论

3.1 大量元素对白芨种子萌发及原球茎生长的影响

MS是植物组培中常用的一种培养基，因其营养成分丰富，各元素比例适中，在植物的胚、原球茎、茎段等组培中得到了广泛应用[4-8]，而且液体MS培养基同样适用于悬浮细胞培养[9-12]。MS培养基中大量元素的浓度，对植物组培有显著影响。景维杰等研究表明，当大量元素无机盐浓度调整为1/5时，更有利于蝴蝶兰茎尖生长点的生长；在一定浓度范围内，提高硝酸态氮的比例，或者提高钾离子浓度，均对蝴蝶兰茎尖生长点培养有利[13]。除了兰科植物，大量元素浓度的改变对其他植物组培也有影响，如大量元素中钙盐浓度不变，其余元素浓度降低为2/3，再与激素配合，均可以促进山桐子愈伤组织的诱导、芽的分化和增殖等[14]。

本研究采用MS基本培养基，筛选试验了多个浓度的大量元素对白芨种子萌发及原球茎生长的影响，结果显示大量元素浓度的改变对白芨种子萌发时间、原球茎直径、原球茎干质量影响显著，且1/4MS培养基效果最佳。无独有偶，刘晓燕等报道，与白芨同为兰科植物的蝴蝶兰原球茎增殖速度随着MS培养基中大量元素浓度的升高而降低，即降低大量元素浓度促进了白色花系蝴蝶兰原球茎的增殖[15]。然而，大量元素浓度影响植物组培效果的机理还需进一步研究。

3.2 外源植物激素及复合性营养物质对白芨种子萌发及原球茎生长的影响

植物激素对植物生长发育的巨大调节作用毋庸置疑，细胞分裂素与生长素的相互作用及其浓度比例决定了植物组织的发育方向——分化或脱分化[16-17]。在本研究中，外源添加的NAA和6-BA的浓度对种子的萌发与原球茎生长发挥了重要作用，且作用显著。然而，在未添加外源NAA及6-BA时，原球茎干质量也能达到所有处理组的中等水平。这可能是因为内源的生长素及细胞分裂素作用强度高于外源添加激素的作用。

已有多个研究证明，外源添加一些复合性营养物质，如马铃薯汁、香蕉汁、椰子汁等，可以促进种子萌发及原球茎的生长发育[18-20]。本研究结果显示，外源添加物质对白芨种子萌发时间和原球茎生长有很大影响，在考察的7个因素中，外源添加物质的影响程度最大。外源添加的复合营养物质对原球茎直径及原球茎干质量影响极显著。有研究表明，椰子汁可以促进白色花系蝴蝶兰原球茎的增殖[15]。然而，本研究结果表明，蝴蝶兰与白芨虽同为兰科植物，但马铃薯汁更有利于白芨种子的萌发及原球茎的生长。这同谢玲玲等的研究结果相似，即添加了马铃薯的KC培养基上，白芨种子的发芽率最高[21]。总之，外源复合性营养物质在植物组培中的积极作用被越来越多地研究证明，但是不同营养物质对哪些植物组培有影响，具体是哪些成分在起作用，还需要进一步研究证实。

3.3 培养方式对白芨快繁的影响

在植物组培过程中，最常用的是固体培养基；而在某些植物培养过程中，采用液体培养有着固体培养基不可比拟的优势。例如，在液体培养基中诱导培养的大花蕙兰原球茎质量显著优于源于固体培养基的原球茎质量，其增殖系数和鲜质量明显提高[22]。Zuraida等在研究以液体振荡培养方式培养菠萝幼芽时发现，菠萝幼芽在液体培养基中的增殖速度是在固体培养基上的9倍[23]。然而，在现有的报道中还很少有采用液体培养白芨种子及原球茎的研究，本研究通过第1阶段的液体振荡培养和第2阶段的固体培养，以求克服全程固体培养的弊端，在培养过程中，种子和原球茎能充分接触营养物质，吸收营养、代谢快，加快了种子萌发和原球茎生长发育速度，最终提高了白芨种子萌发率，也提高了原球茎的鲜质量和干质量。这些优势最终体现在了白芨快繁苗的质量上。此外，将原球茎从组培瓶取出放置在分化培养基上时，操作省时省力，大大减少了工作量。

值得一提的是，在用这2种培养方式培养兰科植物种子及原球茎时，在培养基单位体积内种子数量、原球茎数量与种子萌发速率和原球茎的生长速率也有关系[24-26]。本试验采用定量接种，使得每个处理的液体培养基中单位体积内的种子数量基本保持一致，最大程度地降低了因接种密度不同所导致的试验误差。这种接种方法同样也适用于兰科其他植物种子萌发与原球茎生长研究。

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