利用柠檬酸脱除鲢鱼鱼鳞中钙的工艺条件优化

胡爱军，宋飞莹，郑捷，曲莹，曹园园

（1.天津科技大学食品工程与生物技术学院，天津300457；2天津市宽达水产食品有限公司，天津300304）

利用柠檬酸脱除鲢鱼鱼鳞中钙的工艺条件优化

胡爱军1，2，宋飞莹1，郑捷1，曲莹1，曹园园1

（1.天津科技大学食品工程与生物技术学院，天津300457；2天津市宽达水产食品有限公司，天津300304）

以柠檬酸为脱钙剂，研究搅拌条件下鲢鱼鱼鳞的脱钙条件，并通过扫描电子显微镜对脱钙前后鱼鳞的表面结构进行观察对比。采用单因素及正交试验，考察料液比、脱钙时间及柠檬酸浓度对鱼鳞脱钙效果的影响。结果表明，最佳工艺参数为：料液比1∶20（g/mL），脱钙时间120 min，柠檬酸浓度3.5%，在此条件下，脱钙率可达到95.23%，电镜结果显示，脱钙能使鲢鱼鱼鳞的蛋白质裸露出来，有利于鱼鳞蛋白质的提取。

鲢鱼；鱼鳞；柠檬酸；脱钙；表面结构

中国作为淡水鱼大国，其产量一直稳居世界前列[1]。白鲢（Hypophthalmichthys molitrix），作为中国四大家鱼之一，饲养广泛，2015年产量为435.5万吨，少于草鱼位居第二[2]。虽然我国淡水养殖业发展迅猛，但水产品的深加工与综合利用都低于国际水平[3]，淡水鱼的加工比例仅为17%，远低于我国海水产品的加工比例（53.57%）[4]。在鱼类加工中，大约30%的副产品由鱼皮、鱼鳞、鱼骨组成，其中鱼鳞约占其中的15%[5]。所有的后期副产品均含有丰富的蛋白质，这些材料也作为潜在的胶原蛋白和明胶来源得到了越来越多的关注[6]。鱼鳞中的胶原蛋白纤维层的结构是正交式夹层结构，表面有一层羟基磷灰石的覆盖[7]，这种结构增加了鱼鳞的加工利用难度，也直接导致了鲢鱼鱼鳞不能广泛加工利用以及大量废弃的现状。

要将鱼鳞中的蛋白质提取出来，必须先对鱼鳞进行脱钙处理。目前，对鱼鳞脱钙的方法主要集中在盐酸、柠檬酸脱钙和EDTA络合法脱钙。刘冬姣等[8]利用响应面法进行了EDTA-4Na脱除鱼鳞钙的工艺优化研究，但是文中并没有指明所用鱼鳞的种类，不同鱼鳞脱钙条件可能会有所不同；黄煜等[9]进行了盐酸脱除罗非鱼鱼鳞钙的工艺优化研究；陈正平等[10]用单因素正交试验研究了磁力搅拌辅助柠檬酸脱除鳙鱼鱼鳞钙的工艺；彭元怀等[11]进行了单因素正交试验优化柠檬酸法脱除罗非鱼鱼鳞钙的工艺研究；陈日春[12]研究了EDTA螯合脱除鲢鱼鱼鳞中钙离子的工艺条件，在单因素试验基础上，采用正交试验优化得到最优的脱钙工艺条件。

考虑到脱钙后的蛋白质提取试验，有研究表明，相比于EDTA法和柠檬酸脱钙法，盐酸脱钙在脱钙的过程中会造成较大的蛋白质损失[6]。而EDTA脱钙法成本较高，目前在工业生产中应用可能性不大。本文采用柠檬酸进行脱钙，不仅具有较小的蛋白质损失率，同时还能得到具有生物活性的柠檬酸钙。因此用柠檬酸进行鱼鳞脱钙可以达到综合利用的目的，实现资源最大化利用[13]。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 材料与试剂

鲢鱼鱼鳞：收集于天津滨海金元宝农贸市场。

柠檬酸、氨水、氯化铵、铬黑T、盐酸羟胺、三乙醇胺、氯化钙、EDTA-2Na、硝酸、高氯酸、硫酸铜、硫酸钾、硼酸、氢氧化钠、盐酸、甲基红、溴甲酚绿、95%乙醇、浓硫酸、石油醚：均为分析纯。

1.1.2 主要仪器设备

FA2204B电子天平：诸暨市超泽衡器有限公司；D-8401WZ电动搅拌器：天津市华兴科学仪器厂；DH-101电热恒温鼓风干燥箱：天津市中环实验电炉有限公司；K9840半自动凯氏定氮仪、S0X406脂肪分析仪：济南海能仪器股份有限公司；QSL-08消化炉：天津市天宇实验仪器有限公司；SU-1510扫描式电子显微镜：日本日立公司。

1.2 方法

1.2.1 鲢鱼鱼鳞基本成分测定

水分测定：GB 5009.3-2010《食品安全国家标准食品中水分的测定》直接干燥法；灰分含量的测定：GB 5009.4-2010《食品安全国家标准食品中灰分的测定》马福炉灰化法；脂肪含量的测定：GB/T 5009.6-2003《食品中脂肪的测定》索氏抽提法；蛋白质含量的测定：GB 5009.5-2010《食品安全国家标准食品中蛋白质的测定》微量凯氏定氮法。

1.2.2 鱼鳞脱钙工艺

原料鱼鳞反复清洗，去除杂质后40℃烘至鱼鳞表面完全干燥，浸入酸液中，搅拌使体系处于全混流状态，脱钙一段时间，过滤，弃去滤液。脱钙鱼鳞用蒸馏水反复冲洗，40℃干燥备用。

1.2.3 脱钙率测定

原料总钙离子含量及脱钙液中的钙离子含量用EDTA络合滴定法测定[13]。

脱钙率计算：

式中：h1为脱钙液中的钙离子含量，mg/mL；h0为总钙离子含量，mg/g；v为脱钙液总体积，mL；m为脱钙鱼鳞质量，g。

1.2.4 不同因素对脱钙率的影响

柠檬酸浓度对脱钙率的影响：称取一定量鱼鳞，按料液比1∶20（g/mL）分别加入不同浓度（质量分数）的柠檬酸溶液（0.5%、1.5%、2.5%、3.5%、4.5%、5.5%），搅拌脱钙120 min，考察柠檬酸浓度对脱钙率的影响。

脱钙时间对脱钙率的影响：称取一定量鱼鳞，按料液比1∶20（g/mL）加入2.5%的柠檬酸溶液，进行搅拌脱钙，测定不同脱钙时间（10、20、40、60、80、100、120、160、200 min）下的脱钙率，考察脱钙时间对脱钙率的影响。

料液比对脱钙率的影响：称取一定量鱼鳞，分别按料液比1∶10，1∶15，1∶20，1∶25，1∶30（g/mL）加入浓度为2.5%的柠檬酸溶液，搅拌脱钙120 min，考察不同料液比对脱钙率的影响。

1.2.5 脱钙工艺参数优化

以柠檬酸浓度，反应时间，料液比为影响因素，依据单因素试验的结果选择合适的影响因素水平，以脱钙率为考察指标，设计三因素三水平L9（34）的正交试验。

1.2.6 鱼鳞脱钙前后表面结构分析

将脱钙前的鲢鱼鱼鳞与脱钙后的鱼鳞冷冻干燥后，表面喷金，于扫描电子显微镜下观察。

2 结果与分析

2.1 鲢鱼鱼鳞基本成分

鲢鱼鱼鳞基本成分测定结果见表1。

表1 鲢鱼鱼鳞基本成分分析Table 1 The composition analysis of silver carp scale

表1表明，鲢鱼鱼鳞中蛋白质含量为64.23%，充分说明了鱼鳞蛋白综合利用的必要性。灰分含量较高，在提取蛋白之前需要先进行脱钙处理。

2.2 单因素试验结果与分析

2.2.1 钙离子标准曲线

钙离子标准曲线图见图1。

图1 钙离子标准曲线Fig.1 Standard curve of Ca2+

根据数据绘制标准曲线，拟合出回归方程为：y=0.089 7x-0.142 6

式中y为钙离子浓度，mg/mL；x为EDTA滴定体积，mL；相关系数R2=0.999 8，相关性良好。

2.2.2 柠檬酸浓度对脱钙率的影响

柠檬酸浓度对脱钙率的影响见图2。

图2 柠檬酸浓度对脱钙率的影响Fig.2 Effect of citric acid concentration on decalcification rate

由图2可知，柠檬酸浓度低于2.5%时，随着柠檬酸浓度的增大，脱钙率持续升高，当柠檬酸浓度超过2.5%后，随柠檬酸浓度的增大，脱钙率的升高不再明显，3.5%之后逐渐趋于稳定。原因可能是，柠檬酸浓度较低时，提高反应物的浓度，能够加快钙离子与柠檬酸的反应速率，使脱钙率呈上升趋势。当柠檬酸浓度超过2.5%后，此时体系中的柠檬酸已经能够满足钙离子的反应需求，体系已趋于平衡，此时提高柠檬酸浓度，脱钙率不再上升。

2.2.3 脱钙时间对脱钙率的影响

脱钙时间对脱钙率的影响见图3。

图3 反应时间对脱钙率的影响Fig.3 Effect of reaction time on decalcification rate

由图3可以看出，脱钙时间小于120 min时，随着脱钙时间的增加，脱钙率不断升高，当脱钙时间超过120 min后，进一步提高反应时间，脱钙率升高不再明显。可能的原因是，时间小于120 min时，随着时间增加，鱼鳞中的钙离子与柠檬酸有了更多的接触时间，反应更易趋近平衡，使脱钙率呈持续上升趋势。当时间大于120 min后，反应体系中的钙离子已经基本反应完全，脱钙率不会再随着时间的增加升高。

2.2.4 料液比对脱钙率的影响

料液比对脱钙率的影响见图4。

图4 料液比对脱钙率的影响Fig.4 Effect of solid-liquid ratio on decalcification rate

料液比从1∶10（g/mL）变化到1∶20（g/mL），脱钙率不断上升，当料液比达到1∶20（g/mL）后，进一步提高溶液体积对脱钙率的影响并不显著，这可能是因为当柠檬酸浓度不变时，随着溶液体积的增加，鱼鳞分散得更完全，与柠檬酸的接触更加充分，从而有利于脱钙率的提高；当料液比增加到1∶20（g/mL）之后，鱼鳞中钙离子对柠檬酸的需求基本达到饱和状态，增加溶液体积，脱钙率不再升高。

2.3 正交试验结果

选择柠檬酸浓度、脱钙时间、料液比为考察因素，以脱钙率为考察指标，每个因素取3个水平，采用L9（34）正交表进行正交试验优化脱钙工艺。正交试验因素与水平见表2，试验结果见表3。

表2 正交试验因素水平表Table 2 The factors and levels of orthogonal experiment

表3 L9（34）正交试验极差分析结果Table 3 Range analysis of L9（34）orthogonal test

由表3中极差R可知各因素对鱼鳞脱钙效果影响程度相对大小的顺序为：柠檬酸浓度＞反应时间＞料液比。由脱钙率所确定的最优工艺条件组合为A3B2C2，即柠檬酸浓度3.5%，脱钙时间120 min，料液比1∶20（g/mL）。

为了明确各因素对脱钙率影响的显著性，进一步对表3中的试验结果进行方差分析，方差分析结果见表4。

表4 方差分析表Table 4 Results of variance analysis

由表4方差分析结果表明，各因素对脱钙率均有影响，其中，柠檬酸浓度对脱钙率有极显著影响，脱钙时间对脱钙率有显著影响，料液比对脱钙效果有一定影响。这表明在柠檬酸脱钙过程中，柠檬酸浓度和脱钙时间是决定脱钙率的关键因素。

由正交试验结果得到的脱钙最佳工艺参数为柠檬酸浓度3.5%，脱钙时间120min，料液比1∶20（g/mL）。这个组合没有出现在正交表中，因此需要对正交结果进行验证：验证试验平行做3次，取平均值，测得其验证产品的脱钙率为95.23%，大于正交表中的最大值92.30%，因此试验最终确定的脱钙最佳工艺参数为：柠檬酸浓度3.5%，脱钙时间120 min，料液比1∶20（g/mL）。

2.4 脱钙后鲢鱼鱼鳞基本成分

脱钙后鱼鳞基本成分见表5。

表5 脱钙后鲢鱼鱼鳞基本成分分析Table 5 The composition analysis of decalcified silver carp scale

由表5，脱钙后鱼鳞中蛋白含量达到了86.9%，基本上可以算是一种粗蛋白了，钙质的脱除能够降低鱼鳞蛋白质提取的难度。

2.5 脱钙前后鱼鳞表面结构分析

为了更直观地分析脱钙对鱼鳞表面结构的影响，对脱钙前后鱼鳞表面结构进行了扫描电镜观察。结果见图5、图6。

图5 未脱钙鱼鳞表面结构Fig.5 The surface structure of undecalcified scale

通过电镜扫描结果比较，未脱钙的鱼鳞表面比较平整致密，未见明显的突起或凹陷，这是由于鱼鳞表面被羟基磷灰石等无机矿物质覆盖；经过脱钙处理的鱼鳞表面变得粗糙，出现规则排列的明显条纹状突起，这是由于鱼鳞表面钙质被脱除，鱼鳞中纤维状的蛋白质结构裸露出来，并且表面结构变得疏松，这有利于后续蛋白质的提取。

图6 脱钙后鱼鳞表面结构Fig.6 The surface structure of decalcified scale

3 结论

柠檬酸脱钙可以脱去大部分的钙质，使鱼鳞表面结构变得疏松，有利于后续蛋白质的提取。影响脱钙率的因素主次大小顺序为柠檬酸浓度＞反应时间＞料液比，其中柠檬酸浓度和反应时间是影响脱钙率的显著因素。通过单因素和正交试验最终确定柠檬酸脱钙的最优工艺参数为：在搅拌条件下，柠檬酸浓度为3.5%，反应时间为120 min，料液比为1∶20（g/mL）。在此条件下脱钙率为95.23%，脱钙效果良好。

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Study on Decalcification Condition of Silver Carp（Hypophthalmichthys molitrix）Scales with Citric Acid

HU Ai-jun1，2，SONG Fei-ying1，ZHENG Jie1，QU Ying1，CAO Yuan-yuan1
（1.College of Food Engineering and Biotechnology,Tianjin University of Science&Technology,Tianjin 300457,China；2.Tianjin City Kuanda Aquatic Food Co.,Ltd.,Tianjin 300304,China）

The process conditions of citric acid removal the calcium ions from the silver carp fish-scale were studied.The surface structures of undecalcified fish scale and decalcified fish scale were observed by scanning electron microscope（SEM）.The effects of solid-liquid ratio，reaction time and citric acid concentration on the decalcification of fish scales were investigated and the optimal technological parameters were separately to be 1∶20（g/mL），120 min and 3.5%.Under the optimal conditions，decalcification rate was 95.23%.SEM results showed that decalcification could be favorable for the extraction of fish scale protein.

silver carp；fish scale；citric acid；decalcification；surface structure

2016-12-07

中国博士后科学基金面上资助项目（2013M540211）；天津市农业科技成果转化与推广项目“天津两种优势鱼种中餐工业化调理食品加工关键技术的开发与应用”；天津科技大学科学研究基金资助项目（20110104）；天津市东丽区科技型中小企业发展专项资金产学研合作项目“复合型鱼糜制品加工关键技术开发与应用”

胡爱军（1968—），男（汉），教授，研究生导师，博士，研究方向：食品加工及超声技术。

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.16.017