硝普钠与尼莫地平治疗大鼠脑出血损伤的疗效及与凝血酶受体-1表达的相关研究

周燕利，聂琼芳，吴晓兰

（武汉理工大学医院 神经内科，湖北 武汉 430010）

硝普钠与尼莫地平治疗大鼠脑出血损伤的疗效及与凝血酶受体-1表达的相关研究

周燕利，聂琼芳，吴晓兰

（武汉理工大学医院 神经内科，湖北 武汉 430010）

目的探讨硝普钠与尼莫地平治疗大鼠脑出血（ICH），降低大鼠脑血肿及脑出血后神经元损伤的疗效及与凝血酶受体-1（PAR1）表达的相关性。方法用30只雄性Wista大鼠（200～220 g）复制脑出血ICH模型，并随机分为3组（每组10只），分别是假手术组、脑出血组和联合治疗组。大鼠于ICH手术成功后48 h处死，收集大鼠脑组织备用。采用TUNEL法检测细胞凋亡的发生；干燥法检测大鼠脑组织水含量；采用免疫组织化学法和蛋白质印迹法Western blot检测PAR1蛋白的表达。结果与假手术组比较，脑出血组和联合治疗组中凋亡细胞数和脑组织水含量增多（均P=0.000），而联合治疗组中凋亡细胞数和脑组织水含量低于脑出血组（均P=0.000）；与假手术组PAR1蛋白含量（0.673±0.121）比较，脑出血组PAR1蛋白含量（2.187±0.233）和联合治疗组PAR1蛋白含量（1.434±0.168）上升，差异有统计学意义（P=0.000），与脑出血组比较，联合治疗组PAR1蛋白含量下降，差异有统计学意义（P=0.000）；Western blot结果与免疫组织化学结果一致。结论硝普钠与尼莫地平通过对PAR1的调控治疗大鼠脑出血损伤，具有神经保护作用。

脑出血；硝普钠；尼莫地平；凝血酶受体-1

Abstract:ObjectiveTo investgate the effect of sodium nitroprusside and nimodipine on cerebral hemorrhage(ICH)in rats and its correlation with expression of thrombin receptor-1 (PAR1).MethodsThirty male Wistar rats(200-220 g)were randomly divided into 3 groups(n=10 each):sham operation group,cerebral hemorrhage group and combination therapy group.Rats were sacrificed 48 hours after successful ICH operation.The apoptosis of neurons was detected by TUNEL method.The water content of brain tissue was detected.The expression of thrombin receptor-1 (PAR1)protein was detected by Immunohistochemistry and Western blot.ResultsCompared with the sham group,the number of apoptotic cells and water content in cerebral hemorrhage group and combination therapy group were significantly increased (P=0.000),while the number of apoptotic cells and water content of brain tissue in combination group were significantly lower than the cerebral hemorrhage group (P=0.000).Compared with sham group,PAR1 protein expression in cerebral hemorrhage group(2.187±0.233)and PAR1 protein expression in ICH group(1.434±0.168)were significantly increased(0.673±0.121) (P=0.000).Compared with ICH group,the PAR1 protein expression in the combination group significantly decreased (P=0.000),and the difference was statistically significant (P=0.000).The results ofwestern blot were consistent with immunohistochemical results.ConclusionsSodium nitroprusside and nimodipine have neuroprotective effects on cerebral hemorrhage by regulating the expression of thrombin receptor-1(PAR1)in rats.

Keywords:cerebral hemorrhage;sodium nitroprusside;nimodipine;thrombin receptor-1

脑出血（intracerebral hemorrhage，ICH）是一种常见的神经外科疾病，其死亡率是急性脑血管病中最高的，严重危害人类的健康[1]。近年研究表明，脑出血后血肿产生的凝血酶与脑出血后的周围组织水肿、神经细胞凋亡、血脑屏障破坏及脑组织损伤等过程密切相关[2-3]。正常生理情况下，凝血酶通过作用于脑组织内凝血酶受体-1（protease activated receptor-1，PAR1）介导细胞毒性作用，而凝血酶抑制剂可减轻脑出血后脑组织水肿及神经损伤[4-5]。脑出血后如何调控PAR1的变化，对脑出血损伤机制的研究及临床治疗具有非常重要的意义。硝普钠作为一种强效的周围血管扩张剂[6]，可与尼莫地平共同作用，改善脑血流量并促进脑细胞恢复改善脑循环[7]。本研究旨在探讨硝普钠与尼莫地平联合作用调控PAR1治疗脑出血损伤的机制，复制大鼠脑缺血ICH模型，观察硝普钠与尼莫地平降低大脑血肿及改善其预后的作用。

1 材料与方法

1.1 主要试剂与仪器

一抗兔抗多克隆抗体PAR1（美国Santa Cruz生物技术有限公司），二抗碱性磷酸酶标记山羊抗兔IgG（北京中杉金桥生物技术有限公司），细胞凋亡检测试验盒、免疫组织化学二氨基联苯胺（Diaminobenzidine，DAB）显色试剂盒（上海碧云天生物工程有限公司）。

1.2 实验动物与分组处理

30只雄性Wista大鼠（200～220）g（购于北京维通利华实验动物技术有限公司）。Wista大鼠饲养在温度为（22±2）℃的无特定病原体（specific pathogen free，SPF）级动物实验室，昼夜循环12 h/12 h光照。成功复制大鼠ICH模型后，随机分为3组（每组10只），分别是假手术组、脑出血组和联合治疗组。硝普钠与尼莫地平在模型成功后6 h经腹腔注射1.0 mg/kg（1∶1），每隔12 h注射1次。大鼠于ICH手术成功后48 h被处死，收集大鼠脑组织备用。

1.3 方法

1.3.1 Rosenberg法脑出血模型复制 称重后给予大鼠（300 mg/kg）腹腔注射10%水合氯醛，麻醉后大鼠俯卧位于立体仪上固定。暴露大鼠颅骨并将骨膜剥离，用微量注射仪取大鼠自体不凝血80 μl，缓慢注入左侧大鼠尾状核部位，留针10 min后撤针，消毒缝合切口，即复制ICH模型。假手术组不注血，其余步骤同上。联合治疗组术后1h给予腹腔注射硝普钠（1.0 mg/kg）与尼莫地平（1.0 mg/kg）；脑出血组与假手术组术后1 h给予生理盐水腹腔注射。手术后按Longa 5分制标准进行评分：①0分，无明显神经病学症状；②1分，不能完全伸展左前肢；③2分，向左侧旋转；④3分，行走时向左侧倾倒；⑤4分，不能自行行走，有意识障碍。动物苏醒后，观察缺血动物的神经功能缺失症状。累积>1分即为成功模型。

1.3.2 TUNEL原位凋亡细胞检测 大鼠腹腔注射麻醉后，依次使用生理盐水200 ml和4%多聚甲醛200 ml进行心脏灌注固定。脑组织常规脱水透明，并用石蜡包埋连续切片3张（8μm/张）。①切片加入标记液恒温37℃孵育2h，加入生物素恒温孵育30min；②链霉亲和素-生物素复合物试剂37℃恒温孵育30min，加入DAB显色液进行显色。切片用物镜（×10）（×40）显微镜进行观察，细胞核中有棕黄色颗粒者视为凋亡细胞，切片随机选择5个高倍镜视野，进行凋亡细胞计数（×400），平均值视为凋亡细胞数。

1.3.3 干燥法测脑组织水含量 大鼠麻醉后断头处死，应用干湿比重法，取大脑前部组织立即测湿重。将组织块放入电热烘箱中100℃烘烤24 h至恒重，再称干重。按下列公式计算出组织水含量：脑组织水含量（%）=（湿重-干重）/湿重×100%。

1.3.4 免疫组织化学法检测PAR1表达 制备大鼠脑组织石蜡切片，切片用磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）清洗，滴入5%血清进行30 min室温封闭，切片加入1∶1 000的PAR1一抗进行4℃孵育过夜。隔天取出切片PBS清洗，加入1∶1 000的二抗进行37℃孵育30 min。PBS复洗并加入霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶进行37℃恒温反应30 min，加入DAB 显色液进行，用物镜（×10）（×40）显微镜进行观察。阳性表达PAR1主要表现是细胞内出现棕黄色颗粒，用（×40）物镜显微镜观察，随机选择6个高倍视野，计算PAR1蛋白含量的平均光密度值（mean optical density，MOD）。MOD=累积光密度与面积的比值，用于反映组织中PAR1蛋白含量。

1.3.5 Western blot检测PAR1蛋白表达水平 取大脑组织冰上裂解2h，离心后用BCA蛋白浓度（bicinchoninic acid，BCA）试剂盒进行蛋白浓度检测，将各组蛋白浓度总量调整为30μg/μl。将各组蛋白样品加入到10%十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳，转膜至聚偏二氟乙烯膜后按1∶1 000的稀释比例加入多克隆抗体PAR1和二抗。用增强化学发光法显色剂显色，用Bio-Pro凝胶成像分析仪成像以及用Quantity-one软件对各泳道条带进行灰度扫描得出相应蛋白表达量。

1.4 统计学方法

数据分析采用SPSS 21.0统计软件，计量资料以均数±标准差（±s）表示，比较做单因素方差分析，两两比较用Bonferroni's Multiple Comparison Test检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 神经组织学评分结果

脑出血组0分1只，5只判定为1分，2只判定为2分，2只判定为3分；联合治疗组，6只判定为1分，1只判定为2分，1只判定为3分。3组间秩和检验（H检验），差异有统计学意义（H=16.7298，P=0.0002）。

2.2 凋亡细胞数检测结果

假手术组仅见极少数的凋亡细胞，脑出血组和硝普钠与尼莫地平联合治疗组的凋亡细胞数量上升。假手术组脑凋亡细胞数量（3.57±0.61）、脑出血组凋亡细胞数量（26.31±1.27）和联合治疗组凋亡细胞数量（13.64±1.31）比较，差异有统计学意义（F=1052，P=0.000）。与假手术组比较，脑出血组的凋亡细胞数量增多，差异有统计学意义（t=45.78，P=0.000）；硝普钠与尼莫地平联合治疗组的凋亡细胞数量也增多，差异有统计学意义（t=20.27，P=0.000）；与脑出血组比较，联合治疗组中的凋亡细胞数降低，差异有统计学意义（t=25.21，P=0.000）。见图 1。

2.3 脑组织水含量

假手术组脑组织水含量（71.418±2.254）g、脑出血组脑组织水含量（84.131±1.982）g和联合治疗组脑组织水含量（75.656±1.771）g比较，差异有统计学意义（F=103.7，P=0.000）。与假手术组脑组织水含量比较，脑出血组的水含量增多，差异有统计学意义（t=14.14，P=0.000）；硝普钠与尼莫地平联合治疗组的水含量也增多（t=4.718，P=0.000），差异有统计学意义；与脑出血组比较，联合治疗组中的水含量降低，差异有统计学意义（t=9.424，P=0.000）。

2.4 各组PAR1蛋白含量比较

脑出血组和硝普钠与尼莫地平联合治疗组中的PAR1蛋白染色强度增强，大鼠脑组织中PAR1呈高表达状态（见图2）。光密度结果显示，假手术组脑组织PAR1蛋白含量（0.673±0.121）、脑出血组PAR1蛋白含量（2.187±0.233）和联合治疗组PAR1蛋白含量（1.434±0.168）比较，差异有统计学意义（F=180.100，P=0.000）。与假手术组比较，脑出血组PAR1蛋白含量增多，差异有统计学意义（t=18.980，P=0.000）；硝普钠与尼莫地平联合治疗组PAR1蛋白含量也增多，差异有统计学意义（t=9.490，P=0.000）。与脑出血组比较，联合治疗组PAR1蛋白含量下降，差异有统计学意义（t=9.490，P=0.000）。

2.5 各组的PAR1蛋白表达量比较

Western blot分析显示，假手术组脑组织PAR1蛋白表达量（0.943±0.448）、脑出血组PAR1蛋白含量（2.311±0.547）和联合治疗组PAR1蛋白含表达量（1.627±0.493）比较，差异有统计学意义（F=18.89，P=0.000）。与假手术组比较，脑出血组PAR1蛋白表达量增多，差异有统计学意义（t=6.147，P=0.000）；硝普钠与尼莫地平联合治疗组PAR1蛋白表达量也增多，差异有统计学意义（t=3.037，P=0.000）。与脑出血组比较，联合治疗组PAR1蛋白含量降低，差异有统计学意义（t=3.037，P=0.000）。见图3。

图1 各组的凋亡细胞数 （×400）

图2 各组的PAR1蛋白含量 （×400）

图3 各组的PAR1蛋白表达量变化

3 讨论

脑出血具有高发病率、高致残率及高死亡率的特点，严重危害人类的健康[1，8]。脑出血后血肿产生的凝血酶及PAR1与脑组织周围的继发性损伤密切相关[2-3]。硝普钠是一种速效、短时的血管扩张药[9]，对动脉和静脉的平滑肌有扩张作用，减轻周围血管阻力，是治疗脑出血的首选药物之一[10-12]；尼莫地平作为钙离子拮抗剂，可透过血脑屏障、减轻脑细胞钙超载，使血肿周围血流量和血管性水肿减轻[13-14]。研究表明硝普钠与尼莫地平对颅脑损伤脑功能恢复均有明显的疗效[15-16]。

本研究旨在探讨硝普钠与尼莫地平联合作用调控PAR1治疗脑出血损伤的机制。研究结果显示，与假手术组比较，脑出血组和硝普钠与尼莫地平联合治疗组的凋亡细胞数及脑组织水含量增加，表明大鼠脑出血脑水肿模型复制成功，发生细胞凋亡；联合治疗组中的凋亡细胞数及脑组织水含量低于脑出血组，说明脑出血后给予硝普钠与尼莫地平可有效缓解脑出血损伤，减少细胞凋亡。免疫组织化学检测PAR1蛋白含量可知，脑出血后PAR1的含量上升，调控脑组织血流量及水肿的变化；同时发现，硝普钠与尼莫地平的联合使用可有效降低PAR1蛋白含量，有效作用于凝血酶受体来缓解脑出血损伤。

综上所述，硝普钠与尼莫地平可以通过调节PAR1产生抗细胞凋亡作用，降低大脑血肿及改善神经损伤，这对于临床治疗脑出血水肿、缓解神经元损伤具有重要的意义。

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Efficacy of nitroprusside and nimodipine in treatment of cerebral hemorrhage in rats and its correlation with thrombin receptor-1 expression

Yan-li Zhou,Qiong-fang Nie,Xiao-lan Wu
(Department of Neurology,Wuhan University of Technology Hospital,Wuhan,Hubei 430010,China)

R743.34

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2017.15.006

1005-8982（2017）15-0029-05

2017-01-03

吴晓兰，E-mail：76767508@qq.com