miR-30a-5p对肺癌细胞增殖与迁移的影响及其机制*

邱会，胡敏，钟敏钰

（1.湖北省武汉市第一医院 肿瘤科，湖北 武汉 430022；2.华中科技大学同济医学院附属武汉中心医院 血管外科，湖北 武汉 430000）

基础研究·论著

miR-30a-5p对肺癌细胞增殖与迁移的影响及其机制*

邱会1，胡敏2，钟敏钰1

（1.湖北省武汉市第一医院 肿瘤科，湖北 武汉 430022；2.华中科技大学同济医学院附属武汉中心医院 血管外科，湖北 武汉 430000）

目的研究miR-30a-5p对非小细胞肺癌（NSCLC）增殖和迁移的影响，并探讨其调控机制。方法NSCLC A549细胞系分成两组，miR-30a-5p组和对照组，分别转染miR-30a-5p mimics和microRNA scramble，MTT实验及细胞划痕实验分别测定两组细胞增殖和迁移能力，实时聚合酶链反应（real time-PCR）和蛋白免疫印迹法（Western blot）分别测定两组泛素蛋白连接酶（UBE3C）mRNA和蛋白质表达水平。结果培养48 h后，miR-30a-5p组相对活细胞百分比低于对照组（[203.7±16.8）%vs（330.4±20.7）%（P=0.000）]；培养72 h后，miR-30a-5p组相对活细胞百分比（258±30.2）%，对照组相对活细胞百分比（403.4±28.4）%，miR-30a-5p组相对活细胞百分比低于对照组（P=0.001）。细胞划痕实验示：miR-30a-5p组划痕愈合率为（23.2±2.7）%，对照组划痕愈合率为（89.2±4.8）%，miR-30a-5p组划痕愈合率低于对照组（P=0.000）。real time-PCR显示，miR-30a-5p组 UBE3C mRNA表达水平为（0.15±0.02），对照组UBE3C mRNA表达水平为（1.03±0.09），miR-30a-5p组UBE3C mRNA表达水平低于对照组（P=0.000）；Western blot显示，miR-30a-5p组UBE3C蛋白表达水平为（1.57±0.26），对照组UBE3C蛋白表达水平为（5.32±0.42），miR-30a-5p组UBE3C蛋白表达水平低于对照组（P=0.000）。结论miR-30a-5p抑制NSCLC增殖和迁移，其机制与下调UBE3C表达有关。

miR-30a-5p；非小细胞肺癌；增殖；迁移

Abstract:ObjectiveTo investigate the role of miR-30a-5p on the regulation of the proliferation and migration of NSCLC,and its regulatory mechanism.MethodsA549 cells were divided into two groups,miR-30a-5p group(transfected with miR-30a-5p mimics)and control group(transfected with microRNA scrambles).The proliferation and migration ability was measured by MTT assay and wound healing experiment,respectively.The expression level of UBE3C mRNA and protein was measured by RT-PCR and Western blot.ResultsThe relative percentage of living cells in miR-30a-5p group was significantly lower than control group after culturing for 48 h,(203.7±16.8)%vs(330.4±20.7)%,P=0.000.There was(258±30.2)%of relative percentage of living cells in miR-30a-5p group,which was significantly lower than(403.4±28.4)%in the control group(P=0.001).The wound healing rate was (23.2±2.7%)in miR-30a-5p group,which was significantly lower than(89.2±4.8)%in the control group (P=0.000).RT-PCR indicated that the expression level of UBE3C mRNAwas(0.15±0.02)in miR-30a-5p group,which was significantly lower than(1.03±0.09)in the control group(P=0.000).The expression level of UBE3C protein was(1.57±0.26)in miR-30a-5p group,which was significantly lower than(5.32± 0.42)in control group(P=0.000).ConclusionsMiR-30a-5p inhibits cell proliferation and migration of non-small cell lung cancer cell by suppressing UBE3C gene expression.

Keywords:miR-30a-5p;non-small cell lung cancer;proliferation;migration

非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）是肺癌的主要类型，恶性程度高[1-2]。目前，虽然得益于手术、放化疗的进度，NSCLC治疗效果有所进步，但其5年生存率仍不到15%[2]，肿瘤恶性增殖和迁移仍是影响预后的重要原因[3]。深入探讨NSCLC增殖和迁移的机制对设计新的治疗药物具有重要的意义。miR-30a-5p是miR-30家族的成员之一，长度在 22 bp，在肝细胞癌[4]、神经胶质瘤[5]、乳腺癌[6]及结肠癌[7]中被报道调节增殖、凋亡、侵袭和迁移。但是miR-30a-5p在NSCLC发生、发展中的作用尚未见报道。选取2014年3月-2016年1月研究miR-30a-5p对NSCLC增殖和迁移的影响，并探讨其可能的机制。

1 材料与方法

1.1 材料

DMEM培养基、胎牛血清及胰蛋白酶（购自美国Gibco公司），A549细胞（购自美国ATCC公司），Trizol（购自美国Invitrogen公司），实验所需一抗（购自美国Santa Cruz公司），辣根过氧化物酶（HRP）标记的二抗（购自英国 Abcam公司），microRNA scrambles、miR-30a-5p mimics均由上海吉玛公司定制合成，转染试剂LiposomeTM2000（购自美国Invitrogen公司）。

1.2 细胞培养及转染

将A549细胞加入DMEM培养基，于37℃、5%二氧化碳CO2培养箱中培养，48 h后传代。将细胞分为miR-30a-5p组和对照组（Scrambles组），采用LipofectamineTM2000分别转染miR-30a-5p mimics和microRNA scrambles，转染后继续培养24 h。

1.3 细胞增殖能力观察

采用噻唑蓝（MTT）法实验，A549细胞以每孔1×105个细胞接种于12孔板中，培养过夜后行相应的转染实验。在培养中培养48和72 h后添加5 mg/ml的MTT溶液40 μl，孵育4 h后每孔加入200μl二甲基亚砜（DMSO），摇床上充分震荡。490 nm波长测定吸光度值。相对活细胞百分比=（实验组数值/对照组数值）×100%，实验重复3次，取平均值，相对活细胞百分比越高，表示增殖能力越强。

1.4 细胞迁移能力观察

采用细胞划痕实验。将两组细胞培养于6孔板，待细胞融合后，用灭菌枪头沿直线用力划直线。划痕后即刻和48 h在显微镜下观察细胞划痕修复情况，使用Wim Scratch在线图像分析系统测定细胞划痕面积，计算划痕愈合率。划痕愈合率=（划痕后即刻的划痕面积-划痕后48 h的划痕面积）/划痕后即刻的划痕面积×100%。实验重复3次，取平均值。划痕愈合率越高，表示细胞迁移能力越强。

1.5 RNA提取和实时聚合酶链反应

为测量泛素蛋白连接酶（Uniquitin-protein ligase，UBE3C）的mRNA水平，按照Trizol reagent（美国Invitrogen公司）说明书提取总RNA，将所得的RNA使用Im Pron-Ⅱ逆转录系统（美国Roche公司）逆转录。使用SYBR Green PCR master mix试剂（美国Roche公司）在ABI 7500实时PCR仪（美国ABI公司）中进行实时聚合酶链反应（real-time polymerase chain reaction，real time-PCR）。选取的引物如下：UBE3C（正向引物：5'-GTGCCCGGCTGCTTCCGC GGC-3'；反向引物：5'-CCTCCTTCCTGCTCGCGCCG CC-3'）。β-actin基因作为内参（正向引物：5'-TGCA CCCAGCACAATGAA-3'；反向引物，3'-CTAAGTCAT AGTCCGCCTAGAAGCA-5'）。

1.6 UBE3C蛋白表达测定

采用蛋白免疫印迹法（Western blot）。收集两组细胞，加入裂解液提取细胞总蛋白，以每孔30 μg总蛋白上样，浓缩胶80 V电泳40 min，分离胶100 V电泳2 h。常规湿法转膜，5%脱脂奶粉封闭2 h；分别加入UBE3C抗体和GAPDH过夜，抗体稀释度均为1∶200。加入二抗山羊抗鼠1∶1 000孵育2 h。ECL化学发光，凝胶成像系统显影。用Quantity One 1-D分析软件（美国Bio-Rad公司）对蛋白印迹条带进行定量。以目的蛋白测定值与GAPDH的比值作为目标蛋白的相对表达量。

1.7 统计学方法

数据分析采用Graphpad 6.0统计作图软件，计量资料用均数±标准差（±s）表示，计量数据用t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组转染对细胞增殖的影响

培养48 h后，miR-30a-5p组相对活细胞百分比低于对照组[（203.7±16.8）%vs（330.4±20.7）%，t=-8.231，P=0.000]；培养 72 h 后，miR-30a-5p 组相对活细胞百分比（258±30.2）%，对照组相对活细胞百分比（403.4±28.4）%，miR-30a-5p组相对活细胞百分比低于对照组（t=-6.074，P=0.001）。见图1。

2.2 两组转染对A549细胞迁移的影响

细胞划痕实验示，miR-30a-5p组划痕愈合率为（23.2±2.7）%，对照组划痕愈合率为（89.2±4.8）%，miR-30a-5p组划痕愈合率低于对照组（t=-20.757,P=0.000）。见图2。

2.3 miR-30a-5p对UBE3C基因表达的影响

real time-PCR示，miR-30a-5p组UBE3C mRNA表达水平为（0.15±0.02），对照组UBE3C mRNA表达水平为（1.03±0.09），miR-30a-5p组 UBE3C mRNA表达水平低于对照组（t=-16.532，P=0.000）；Western blot示，miR-30a-5p组UBE3C蛋白表达水平为（1.57±0.26），对照组UBE3C蛋白表达水平为（5.32±0.42），miR-30a-5p组 UBE3C 蛋白表达水平低于对照组（t=-13.149，P=0.000）。见图3。

图1 MTT法检测两组相对活细胞百分比

图2 两组划痕后即刻和48 h在显微镜下观察的细胞划痕修复情况

图3 两组UBE3C mRNA和蛋白表达水平

3 讨论

肺癌是个备受关注的全球性健康问题，在西方国家，发病率在逐渐下降，然而在中国，发病率却在持续增长，并且在国内是常见的肿瘤致死性疾病，据国家肿瘤癌症登记中心（national central cancer registry，NCCR）统计，在城市肺癌发病率为52.52/100 000人；在农村，发病率为39.54/100 000人，在所有肿瘤中排第1位。肺癌致死率在所有肿瘤中也排第1位，2010年肺癌死亡率为37/100 000人[8]。NSCLC是肺癌的主要病理类型，恶性程度高，在诊断时往往已经晚期，已经失去手术机会。明确NSCLC的发病机制对提高NSCLC的诊治效果具有重要的意义。

miRNA是一种小的非编码单链RNA，长度约19～22 bp，其可通过在逆转录水平与靶标基因的mRNA的3’非翻译序列相结合，介导靶标mRNA的降解，从而抑制靶标基因的表达[5-6]。miRNA在NSCLC的多种作用已被报道，王富民等人[9]发现，miR-183在无复发者血浆中含量高于复发者，且miR-183是NSCLC患者总生存率的独立影响因素。罗湘玉等人[10]报道，NSCLC组织中miR-222阳性表达率高于正常肺组织，并可能与NSCLC的发生、发展相关。miR-30a-5p是miR-30家族的成员之一，长度为22 bp，JIA等人[5]发现，miR-30a-5p在胶质瘤细胞及组织中呈高表达，且用反义核苷酸下调miR-30a-5p表达可抑制胶质瘤细胞增殖和侵袭，诱导凋亡，提示miR-30a-5p在胶质瘤中起促癌的作用。与之相反，HE等人[4]报道，miR-30a-5p通过靶向AEG-1基因在肝细胞癌细胞系中可抑制细胞增殖，并激活caspase-3/7进而诱导凋亡。代航等人[11]发现，miR-30a-5p可抑制肝癌细胞株SMCC-7721增殖，促进凋亡，抑制其迁移和侵袭能力。通过调控ERK/Ets-1信号通路，miR-30a-5p抑制三阴性乳腺癌增殖、迁移和侵袭[6]。在结肠癌中，miR-30a-5p通过靶向无齿同源蛋白抑制结肠癌生长表明miR-30a-5p在不同的肿瘤中起着相反的作用[7]。

本研究探讨miR-30-5p对非小细胞肺癌A549细胞的增殖与迁移的影响。结果显示，miR-30a-5p组相对活细胞百分比低于对照组，miR-30a-5p组划痕愈合率低于对照组，表明miR-30a-5p在NSCLC中抑制增殖和迁移，起着抑癌的作用，与肝细胞癌[4]、三阴乳腺癌[6]及结肠癌[7]的结果一致，而与胶质瘤[5]的结果相反，可能是由于miR-30a-5p在不同的肿瘤中所起的作用不一致有关。进一步探讨机制发现，miR-30a-5p组UBE3C mRNA和蛋白表达水平低于对照组，UBE3C对多种肿瘤的生长均存在正调控作用，例如，UBE3C促进黑色素瘤细胞的增殖与迁移[12]，UBE3C促进肾细胞癌的迁移[13]，UBE3C促进肝癌肿瘤的生长等[14]，故miR-30a-5p抑癌作用可能与下调UBE3C表达，进而发挥抑制增殖和迁移有关。

综上所述，本研究发现miR-30-5p对非小细胞肺癌具有抑制增殖和迁移的作用，其机制可能与下调UBE3C表达有关，这为NSCLC的增殖及迁移提供新机制，有可能做为新的治疗靶点。

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miR-30a-5p inhibits proliferation and migration of non-small cell lung cancer cell and its mechanism*

Hui Qiu1,Min Hu2,Min-yu Zhong1
(1.Department of Oncology,The First Hospital of Wuhan City,Wuhan,Hubei 430022,China;2.Department of Vascular Surgery,Tongji Medical College,Huazhong University of Science and Technology,the Central Hospital of Wuhan,Wuhan,Hubei 430000,China)

R734.2

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2017.15.001

1005-8982（2017）15-0001-04

2016-09-08

武汉市卫计委临床医学科研项目（No：WZ13Z03）

钟敏钰，E-mail：zhongminyu@126.com