探讨hsa-miR-199a-5p表达对缺血性脑卒中的预测作用

惠素艳

探讨hsa-miR-199a-5p表达对缺血性脑卒中的预测作用

惠素艳

目的：探讨hsa-miR-199a-5p在缺血性脑卒中（IS）患者血清中的表达和意义。方法：收集118例IS患者及125例健康人群的血清标本。通过实时荧光定量PCR（qPCR）检测血清hsa-miR-199a-5p的表达，用ROC曲线分析hsa-miR-199a-5p表达应用于诊断IS的价值，并对hsa-miR-199a-5p表达与研究人群的临床特征进行相关性分析。结果：hsa-miR-199a-5p在IS患者中的表达显著高于健康人群（P＜0.05），且IS患者在疾病的急性期、亚急性期和恢复期时hsa-miR-199a-5p的表达表现出显著的降低趋势（P＜0.05）。hsa-miR-199a-5p的表达与IS患者血清CRP水平呈显著正相关（r=0.782，P＜0.05）。ROC预测结果显示，hsa-miR-199a-5p诊断IS的灵敏度为94.8%，特异度为96.2%，曲线下面积（AUC）为0.812（95%CI为0.613～0.919，P=0.003）。结论：hsa-miR-199a-5p或许可成为IS的生物标志物。

hsa-miR-199a-5p；缺血性脑卒中；表达；意义

缺血性脑卒中（ischemic stroke，IS）是脑卒中最常见的一种类型，以高致残率和病死率等特点严重威胁人类生命安全[1,2]。然而，目前对IS的治疗尚无特效药物，因此采取有效措施控制疾病的发病率具有重要意义。近年来，研究发现微小RNA（miRNAs）作为一类调控基因表达的非编码RNA，在IS发病过程中发挥重要作用，如胡亚梅[3]等发现miR-146aG等位基因，miR-149C等位基因与汉族人群缺血性脑卒中易感性有一定的相关性。hsa-miR-199a-5p作为miRNA中的一员，定位于19号染色体，有学者通过microRNA芯片分析发现在脑卒中患者的外周血中包括hsa-miR-199a-5p在内的数个基因表达升高[4]。然而，目前关于hsa-miR-199a-5p与脑卒中患者的关系国内外未见相关报道。基于此，本研究通过对IS患者及健康成人外周血hsa-miR-199a-5p表达水平进行分析，并分析其表达与IS临床特征的关系，为hsamiR-199a-5p在IS发病中的功能研究提供理论基础。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选择2012年6月至2016年3月我院收治的IS患者118例为观察组。纳入标准：①均符合全国第四届脑血管病学术会议修订的《各类脑血管疾病诊断要点》（1995）中关于脑卒中的诊断标准[5]；②患者于发病后24 h内入院，美国国立卫生研究院卒中量表（NIH stroke scale，NIHSS）评分为4～15分。男62例，女56例；年龄56～74岁，平均（68.5±7.2）岁；高血压66例（55.93%），糖尿病20例（16.95%），高血脂35例（29.66%），吸烟42例（35.59%）；CRP（8.79±3.36）mg/L；NIHSS评分平均（8.34±2.10）分。另选择同期在我院健康体检中心体检，并与观察组年龄、性别等相匹配的健康人125例为对照组，排除既往有脑卒中病史、头部手术史或神经系统疾病等。男67例，女58例；年龄56～74岁，平均（69.1±7.5）岁；高血压34例（27.20%），糖尿病8例（6.40%），高血脂13例（10.40%），吸烟25例（20.00%）；CRP（4.63±2.32）mg/L。2组年龄、性别差异无统计学意义（P＞0.05），2组高血压、高血脂、糖尿病和吸烟所占的比例、血清CRP水平与NIHSS评分差异有统计学意义（P＜0.05）。本研究经我院伦理委员会批准，所有受试者签署知情同意书。

1.2 主要试剂和仪器

TRIzol®试剂、cDNA第一链合成试剂盒和micro RNA SYRB Green实时荧光定量试剂盒购于北京全式金生物技术有限公司，三氯甲烷、异丙醇、无水乙醇购自国药集团化学试剂有限公司，DEPC试剂购自美国Sigma公司，Rotor-Gene 3000 Real-time PCR仪器购自德国Qiagen公司，5417R小型台式高速冷冻离心机购自德国Eppendorf公司。

1.3 方法

1.3.1 RNA的提取 观察组均于急性期（第1～7天）、亚急性期（第8～14天）和恢复期（≥15 d）收集血液标本。按照TRIzol®试剂说明书的步骤，将TRIzol试剂和血清以3∶1的体积比混合，置于冰沙中，依法提取出标本中的总RNA，通过紫外分光光度计法测定总RNA的纯度和浓度，以及凝胶电泳法鉴定RNA的完整性。

1.3.2 逆转录和实时荧光定量PCR（qPCR）提取的总RNA进行逆转录和qRT-PCR。逆转录反应需参照试剂盒说明书进行，反应条件为：16℃，30 min；42℃，42 min；85℃，5 min。结束后立即1µL cDNA产物进行PCR反应。引物由上海生工合成，hsa-miR-199a-5p[6]序列：正链5’-TTCACTCCCATCAGTGTCAGCT-3’，负链5’-CGTGCTTGTACTCC AGTCTCA-3；内参U6序列：正链5’-TGGCAGGACATACTAAAA-3’，负链5’-CGTGCTTCACGATTGCGTGTA-3’。PCR反应程序为：95℃预变性3 min，94℃变性14 s，61℃退火延伸58 s，共42个循环，最后72℃延伸5 min。hsamiR-199a-5p的PCR产物长度为262 bp。反应结束后确认Real Time PCR的扩增曲线和融解曲线，进行PCR定量时制作标准曲线等。为减小因RNA浓度定量误差和RNA逆转录效率误差等的影响，将3次独立实验后所得数据用2-ΔΔCt公式进行分析[7]，计算公式为：△Ct值=目的基因Ct值－内参基因Ct值，△△Ct=△Ct实验－△Ct对照。用计算得到的值判定标本中目的miRNA的表达量的差异。

1.4 统计学处理

采用SPSS 17.0软件对数据进行统计学分析，计量资料以（±s）的方式表达，组间比较采用单因素方差分析，方差齐时组间两两比较用Bonferroni检验，方差不齐时用秩和检验。计数资料采用χ2检验；线性相关性研究采用Spearman法。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 hsa-miR-199a-5p表达情况

qPCR结果显示，观察组的hsa-miR-199a-5p表达高于对照组（t=2.163，P＜0.05），且观察组在急性期、亚急性期和恢复期时hsa-miR-199a-5p的表达表现出降低趋势（F=－1.045，P＜0.05），见图1。

图1 hsa-miR-199a-5p在各组血液标本中的表达

2.2 hsa-miR-199a-5p的表达与研究人群的临床特征的相关性分析

将2组临床特征比较中差异有统计学意义的指标与hsa-miR-199a-5p的表达进行Spearman相关分析，结果显示，hsa-miR-199a-5p的表达仅与观察组血清CRP水平呈显著正相关（r=0.782，P＜0.05），见图2。

图2 观察组血清hsa-miR-199a-5p的表达与CRP的相关性

2.3 血清hsa-miR-199a-5p表达诊断IS的价值

为了确定血清hsa-miR-199a-5p表达在IS诊断中的价值，参照Kobayashi[8]等的方法，采用受试者工作特征曲线（receiver operating characteristic curve，ROC）进行预测，以2.31为界值，结果显示，hsa-miR-199a-5p诊断IS的灵敏度为94.8%，特异度为96.2%，ROC曲线下面积（area under curve，AUC）为 0.812（95%CI为0.613～0.919，P=0.003），适合作为诊断IS的标志物，见图3。

图3 血清hsa-miR-199a-5p表达对IS的诊断价值的ROC曲线

3 讨论

随着我国进入老龄化社会，IS的发病率每年以8.0%左右的速度上升，已成为我国突出的一个公共卫生问题[9]。目前，越来越多研究显示IS是一种受遗传及环境共同影响的多基因、多因素的慢性疾病，尤其与基因表达相关的小分子调控因子——miRNA的表达密切相关，如 Qu等[10]报告 miRNA(MIR)-146a rs2910164的单核苷酸多态性在缺血性脑卒中发病过程中高表达；又如Liu等[11]证实miRNA-SNP rs3735590会影响基因的表达，其高表达与IS和亚临床动脉粥样硬化密切相关。研究表明miRNA有望成为一种新的IS疾病分子标志物。miRNA作为细胞内的调节因子，它可以在转录水平和转录后水平上影响功能基因的表达丰度，据推测人类基因组中有约1/3的基因受miRNA调控[12]。通过检测IS患者外周血液中的miRNA上的多态性位点的变化来监测疾病的发展过程，可能会给IS的治疗提供一种新的手段。

miR-199a位于在人染色体19q13.2，由Lagos[13]等于2003年首先从小鼠细胞中克隆获得。Dai等[14]、Wu等[15]、Jones等[16]研究表明miR-199a与炎症相关，其启动子区存在多个MAPK和NF-κB结合位点，调控IL-8、IL-10、IL-6、TGF-β等炎症因子释放，而IS疾病发展过程中会引起脑神经发生炎症反应，与miR-199a的表达密切相关，如Selvamani等[17]通过动物实验证实在缺血性脑卒中大鼠模型中存在miR-199a高度表达。hsamiR-199a-5p作为miR-199a经过一系列核酸酶的剪切加工得到的成熟miRNA，最新研究显示hsa-miR-199a-5p可能参与颅内动脉血管壁的破裂[18]。本研究中，hsamiR-199a-5p在IS患者中的表达显著高于健康人群（P＜0.05），并且IS患者在疾病的急性期、亚急性期和恢复期时hsa-miR-199a-5p的表达表现出显著的降低趋势（P＜0.05），结果表明hsa-miR-199a-5p表达会增加IS的患病风险。与此同时，ROC预测结果显示hsa-miR-199a-5p诊断IS的灵敏度为94.8%，特异度为96.2%，提示将检测hsa-miR-199a-5p表达应用于IS的诊断具有更小的误诊率和漏诊率。此外，本研究发现hsa-miR-199a-5p的表达与IS患者血清CRP水平呈显著正相关（r=0.782，P＜0.05），究其原因可能与hsa-miR-199a-5p是一个炎症相关基因，其表达升高引起脑部神经炎症反应，进而刺激机体释放大量的CRP。

本研究结果证实hsa-miR-199a-5p可以作为IS早期诊断的生物标志物，通过检测其表达的变化不仅有助于病情的评估，而且可为开展队列研究、病因诊断和治疗手段等研究提供初步的理论依据。

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（本文编辑：王晶）

Expression of hsa-miR-199a-5p in Ischemic Stroke Patients

HUI Su-yan.
Department of Rehabilitation,Affiliated Hospital of Inner Mongolia Medical University,Hohhot 010059,China

Objective:To study the expression of hsa-miR-199a-5p in patients with ischemic stroke(IS).Methods:The serums of 118 IS patients and 125 healthy people at our hospital were enrolled.The expression of hsamiR-199a-5p was detected by real-time quantitative PCR(qPCR).The sensitivity and the specificity were evaluated by the receiver-operating characteristic(ROC)curve and relationship between the expression level of hsamiR-199a-5p and clinical features was analyzed,respectively.Results:The expression of hsa-miR-199a-5p in the IS patients was significantly higher than that in the healthy control(P＜0.05).The expression levels of hsamiR-199a-5p in serum varied at different stages in the IS patients with the lowest expression at the recover stage and highest expression at the acute stage(P＜0.05).Spearman correlation analysis showed that there was a positive correlation between hsa-miR-199a-5p expression and the serum CRP levels(r=0.782,P＜0.05).ROC predictions showed that the sensitivity and specificity of hsa-miR-199a-5p confirmed IS were 94.8%and 96.2%,and area under curve(AUC)was 0.812(95%CI0.613～0.919,P=0.003).Conclusion:Hsa-miR-199a-5p may be used as diagnostic biomarker in IS.

hsa-miR-199a-5p;ischemic stroke;expression;significance

R741;R743.3

ADOI10.16780/j.cnki.sjssgncj.2017.04.004

内蒙古医科大学附属医院康复科呼和浩特 010059

2016-09-29

惠素艳vnp257@163.com