PEG化脂质纳米粒促进积雪草酸口服吸收研究

张雅雯　尹丽娜　黄夏樱　梁泽华　陈晓晓　王胜浩

[摘要]采用溶剂扩散法制备聚乙二醇修饰的积雪草酸（asiatic acid，AA）纳米结构脂质载体（pegylated asiatic acid loaded nanostructured lipid carriers，pAANLC），以结扎肠循环模型考察其在小肠的吸收分布情况，HPLC检测健康SD大鼠灌胃给予pAANLC后的胆汁药物浓度，间接评价PEG化脂质纳米粒的促口服吸收作用。结果显示，经PEG亲水性修饰的NLC在小肠黏膜的穿透能力大大提高，小肠内的转运量显著增加，大鼠体内药物排泄峰值Cmax较普通纳米粒（asiatic acid loaded nanostructured lipid carriers，AANLC）提高了76%，达峰时间tmax减慢，消除半衰期t1/2延长1倍，AUC0→t为AANLC组的15倍，提示AANLC经PEG亲水性修饰后，口服生物利用度显著提高。

[关键词]积雪草酸； 纳米结构脂质载体； 聚乙二醇； 口服吸收

[Abstract]A solvent diffusion method was used to prepare pegylated asiatic acid （AA） loaded nanostructured lipid carriers （pAANLC）， and the ligated intestinal circulation model was established to observe the absorption and distribution in small intestine The concentration of AA in bile after oral administration of pAANLC was detected by HPLC in healthy SD rats to indirectly evaluate the oral absorption promoting effect of PEGmodified namoparticles The results showed that the penetration of pAANLC was enhanced significantly and the transport capacity was increased greatly in small intestinal after PEG modification As compared with the normal nanoparticles （AANLC）， the Cmax of the drug excretion was increased by 76%， the time to reach the peak （tmax ） was decreased and the elimination halflife t1/2 was doubled in the rats after oral administration of pAANLC， and the AUC0→t was 15 times of the AANLC group， indicating that the oral bioavailability of AANLC was significantly improved by hydrophilic modification of PEG

[Key words]asiatic acid； nanostructured lipid carrier； PEG； oral absorption

積雪草酸（asiatic acid，AA）为伞形科积雪草属植物积雪草Centella asiatica L Urban的有效成分之一，属于五环三萜酸，具有治疗皮肤创伤、护肝、抗炎、抗肿瘤等多种药理作用[14]，其代谢产物主要经胆汁排泄。AA水中溶解度极小，胃肠道吸收差，体内消除较快，口服生物利用度低[5]。本实验室早期制备了积雪草酸纳米结构脂质载体（asiatic acid loaded nanostructured lipid carriers，AANLC），但生物利用度改善不显著[6]，这可能与粒子易被高度黏弹性、附着性的肠道黏膜阻挡而无法进入体循环有关[78]。

聚乙二醇（PEG）是一种无毒、无免疫原性及抗原性化合物，被FDA批准可用于注射液、口服制剂。纳米脂质载体经低分子量的PEG（如2 kDa）修饰后，可提高粒子的亲水性，降低静电作用与网状内皮系统的清除速率，提高某些药物的相对生物利用度[911]。因此，本研究以聚乙二醇单硬脂酸酯（PEG2000SA，简称PEG）为修饰材料，制得亲水性的积雪草酸纳米结构脂质载体（pegylated asiatic acid loaded nanostructured lipid carriers，pAANLC），通过比较修饰前后纳米粒在小肠的吸收分布差异和在体内的吸收特点，初步评价亲水性修饰纳米粒改善AA口服吸收的作用。

1仪器与材料

11仪器

LC20AD型高效液相色谱仪（日本Shimadzu公司）；电子天平（AL104，梅特勒托利多仪器（上海）有限公司）；激光共聚焦显微镜（LSM710，Zeiss）；NanoZS90粒径与表面电位分析仪（Malvern Instruments Ltd，UK）；JY922D超声波细胞粉碎仪（宁波新芝生物科技股份有限公司）；LGJ10D冷冻干燥机（北京四环科学仪器厂有限公司）。

12药品与试剂

AA（广西昌洲天然产物开发有限公司，纯度>99%，批号20080625）；甘草次酸（glycyrrhetinic acid，GA，内标，上海晨易生物科技有限公司，纯度>99%，批号200600509）；AANLC与pAANLC（实验室自制）；PEG（PEG2000SA，Tokyo Chemical Industry，Japan）；硬脂胺异硫氰酸荧光素（ODAFITC，实验室自制）；硫酸酯酶（效价23 500 U·g-1）和葡醛酸酶（效价1万 U·mg-1）均购自SigmaAldrich；甲醇、乙腈（色谱纯，Merck KGaA，Germany），其他试剂均为分析纯。

13动物

清洁级雄性SD大鼠，体质量（200±20） g，浙江省实验动物中心提供，合格证号SCXK（浙）20140001。

2方法与结果

21pAANLC的制备与评价

211纳米粒的制备

以单硬脂酸甘油酯与油酸为脂质材料，按照文献方法[12]制备pAANLC。即精密称取10 mg油酸，40 mg单硬脂酸甘油酯，适量PEG及药物AA，溶于3 mL无水乙醇中，70 ℃水浴下加至同温度水中，500 r·min-1机械搅拌5 min后，得带乳光的纳米分散液。该分散液经减压浓缩、冻干，可得固体粉末。以ODAFITC作为荧光标记物替代AA，同法制备荧光标记的纳米粒（NLC与pNLC）。

212纳米粒的理化性质评价

2121粒径大小与表面电位纳米分散液，以水为分散介质，超声分散，用NanoZS90粒径与表面电位分析仪测定pAANLC粒径为（1112±29） nm，表面电位为（-371±09） mV（n=3）。

2122包封率和载药量参考文献方法[12]测定包封率（entrapment efficiency，EE）和载药量（drugs loading efficiency，DL），所采用的色谱方法专属性、准确度和精密度良好。精密称取纳米粒冻干粉末（W0），以30%乙醇溶液为分散介质，超声分散，得分散液。①取该分散液适量，2万 r·min-1离心5 min，精密移取上清液适量，无水乙醇稀释，045 μm微孔滤膜过滤，HPLC测定游离药物量（Wfree）。②精密移取分散液適量，无水乙醇稀释，于70 ℃水浴保温30 min，冷却至室温，045 μm微孔滤膜过滤，HPLC测定续滤液中总药物量（Wtotal）。按照公式（1）与公式（2）计算可得，pAANLC包封率为（911±05）%，载药量为（154±02）%（n=3）。

包封率=（Wtotal-Wfree）/W投药量×100% （1）

载药量=（Wtotal-Wfree）/W0×100% （2）

22大鼠肠道吸收分布考察

221试验方案

采用结扎肠循环模型[7]评价NLC及pNLC在小肠的吸收情况。取自然饮水条件下禁食12 h的雄性SD大鼠腹腔注射戊巴比妥钠溶液麻醉（40 mg·kg-1），背位固定，沿腹中线打开腹腔，小心分离出空肠段，用37 ℃ KrebsRinger溶液冲洗肠内容物，分别注入高、低2档浓度的NLC，pNLC（100，200 mg·L-1，1 mL），将肠管两端结扎，放回大鼠腹腔，2 h后将大鼠处死，取出相应的肠段，冲洗肠段内容物及未被吸收的药物。肠段经冷冻包埋液包埋，冷冻切片及DAPI染色后，用激光共聚焦显微镜观察纳米粒在大鼠小肠的分布情况。

222纳米粒肠道吸收情况

为使纳米粒在小肠的吸收更加可视化，本研究采用双荧光标记法进行，即纳米粒用ODAFITC进行标记（绿色），小肠细胞核以DAPI试剂染色（蓝色）。将纳米粒溶液注入小肠管后，可能会发生3种情况：滞留于小肠管；粘附于黏液纤维上，无法穿过黏液层；穿过黏液层并且进入小肠上皮细胞。

2种纳米粒在小肠微绒毛分布的激光共聚焦图（图1），蓝色荧光代表小肠细胞的细胞核，绿色荧光为纳米粒。结果显示，NLC的绿色荧光只出现在小肠微绒毛的边缘，当提高纳米浓度，仍然只有极少量的粒子透过微绒毛；而经亲水修饰的pNLC能较顺利的穿过小肠微绒毛上的黏液层，且随着纳米浓度的增大，透过黏液层的纳米粒越多，进入到细胞核内部的量也更多。

23大鼠口服吸收的初步评价

231试验方案

取健康雄性SD大鼠10只，分成2组，每组5只，禁食过夜（不禁水）。戊巴比妥钠麻醉，背部固定，沿腹中线打开腹腔，胆总管插管，并结扎固定，缝合创口，采集空白胆汁，待动物清醒后以50 mg·kg-1的剂量分别灌胃给予AANLC与pAANLC分散液（药物质量浓度约5 g·L-1），于给药后0～1，1～2，2～3，3～4，4～5，5～6，6～8，8～10，10～12，12～24 h采集胆汁，记录胆汁体积。

232胆汁样品的处理

精密移取GA溶液25 μL置干燥试管中，氮气吹干，残渣用不同时间胆汁样品50 μL溶解，用002 mol·L-1乙酸调至pH 5，加入硫酸酯酶（011 U·μL-1）和葡醛酸酶（25 U·μL-1）各10 μL，混匀，37 ℃水浴下酶解24 h后立即取出12 000 r·min-1，离心5 min。将上清液移至另一试管，加入甲基叔丁基醚1 mL提取，涡旋5 min，12 000 r·min-1，离心5 min，取上清液氮气吹干。残渣加入EDC·HCl溶液和对甲苯胺溶液适量衍生化3 h，氮气吹干，残余物用甲醇乙腈水（375∶375∶25）100 μL溶解，混匀，12 000 r·min-1，离心5 min，吸取上清液进样分析。

233标准溶液的配制

分别精密称取AA和GA 50 mg，各置50 mL量瓶，用甲醇溶解并定容，得AA和GA贮备液质量浓度1 g·L-1。4 ℃保存，3个月稳定。

精密移取GA贮备液1 mL置25 mL量瓶中，用甲醇定容，摇匀得40 mg·L-1的GA溶液。分别精密移取AA贮备液适量和上述GA溶液25 μL置干燥试管中，氮气吹干，残渣用50 μL空白胆汁混匀，按232项处理，最终制成AA质量浓度为1，2，5，10，20，40，80 mg·L-1的系列溶液。同法制备质控样品质量浓度为2，10，40 mg·L-1。

234HPLC方法的建立与验证

2341色谱条件参考已建立的方法[6]进行：色谱柱 Diamonsil C8（46 mm×150 mm，5 μm）；流动相甲醇乙腈（1∶1）（A），水（B）；梯度洗脱：0～10 min，25% B；10～25 min，11%～25% B，25～28 min，25% B；流速10 mL·min-1；柱温25 ℃；检测波长248 nm；进样量20 μL。

2342方法学评价采用梯度洗脱测定胆汁中的药物浓度，AA保留时间在11 min左右，GA保留时间20 min左右，空白胆汁中的内源性杂质对两者检测均无干扰，显示良好的专属性（图2）。以AA质量浓度Y（mg·L-1）为纵坐标，AA与GA峰高的比值X为横坐标，得线性回归方程Y=4949X+0219（r=0999 5），显示AA在1～80 mg·L-1线性关系良好。方法的日内、日间精密度均<5%，方法回收率>90%，AA与内标的提取回收率均>80%（表1）。

235吸收动力学数据分析

胆汁排泄率计算公式：

胆汁排泄率（μg·h-1）=各时间段胆汁排泄量/t

利用药物统计软件（PKS 10， Shanghai Magnsoft Consulting）计算药动学参数，药物峰浓度Cmax和达峰时间tmax为实测值，排泄速率时间曲线下面积（AUC0t）通过梯形法计算得到。采用SPSS 190统计分析软件进行t检验。

236大鼠口服纳米粒后的吸收动力学

取大鼠灌胃AANLC或pAANLC后收集的胆汁样品适量，经酶解、液液提取富集等技术，采用HPLC方法检测不同时间段胆汁中的药物总浓度。

结果显示，脂质纳米粒经PEG亲水性修饰后，胆汁中Cmax显著提高（提高76%，P<001），达峰时间tmax有所减慢，消除半衰期t1/2延长1倍，AUC0t为修饰前的15倍（表2）。胆汁中总AA排泄速率时间曲线（图3），AANLC经PEG修饰后，体内滞留时间大大延长，药物水平有了明显提高，24 h累计排泄量较修饰前增加了50%（图4）。

3讨论

对NLC进行表面修饰，主要考虑纳米表面的亲水亲脂性、表面电荷及空间特性等因素的影响。粒子表面亲脂性越强，吞噬细胞对其吞噬能力也越大，因此本研究以低分子量的PEG2000SA为材料对纳米粒进行表面修饰，改善其亲水性，以减少吞噬细胞的识别与吞噬。由于SA链与脂质材料有良好的相容性，可作为亲脂端插入到纳米粒的核心，而具有一定柔韧性的PEG链作为亲水端处于纳米粒的表面，伸向水中，使纳米粒的空间结构也发生改变，一方面使粒子间产生足够大的斥力，提高粒子的稳定性而不聚集，另一方面，也能够阻止蛋白质的吸附和躲避网状内皮系统的捕捉，延长纳米粒在体内的循环时间，提高生物利用度[1011]。另外，NLC主要依靠细胞摄取进行转运，经修饰后的NLC细胞旁路途径转运会有较大的增加，转运途径的改变，也可能影响药物吸收[13]。

AA经肠道吸收后，在肝脏发生二相代谢，主要代谢产物为葡醛酸结合物和硫酸酯结合物，且以胆汁途径排泄为主[14]。本研究通过建立清醒大鼠胆汁引流模型，检测胆汁中AA的总浓度可间接反映药物在体内的吸收动力学。本文比较了PEG修饰前后纳米粒的小肠吸收分布与胆汁排泄特征，发现纳米粒的亲水性增大，可明显提高小肠黏膜的透过能力，大大延长药物体内滞留时间，提高药物水平，进一步改善口服生物利用度，为新型纳米制剂的开发利用提供了依据。

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[责任编辑张燕]