肠出血性大肠埃希菌O157：H7多重PCR检测方法的建立

纪 雪，张 雪，孙 洋，孙诗雯，祝令伟，刘 军，姜海艳，周 伟，梁 冰，郭学军，刘彦晶*

(1.军事医学科学院军事兽医研究所，吉林省人兽共患病预防与控制重点实验室，吉林长春 130122；2.长春中医药大学附属医院，吉林长春 130021)



肠出血性大肠埃希菌O157：H7多重PCR检测方法的建立

纪 雪1，张 雪1，孙 洋1，孙诗雯1，祝令伟1，刘 军1，姜海艳2，周 伟1，梁 冰1，郭学军1，刘彦晶2*

(1.军事医学科学院军事兽医研究所，吉林省人兽共患病预防与控制重点实验室，吉林长春 130122；2.长春中医药大学附属医院，吉林长春 130021)

为建立肠出血性大肠埃希菌O157：H7的多重PCR检测方法，针对O157菌特异性eaeA基因、fliC基因、志贺毒素基因(stx1和stx2)及rfbE基因设计5对引物，构建多重PCR反应体系，优化反应的引物浓度和温度检测其特异性和敏感性，并对牛、猪、鸡及犬等不同动物来源的样品进行了大肠埃希菌O157检测。结果显示，该方法具有良好的特异性和敏感性，敏感性达到5×103CFU。从检测阳性样本中均分离到目的菌。应用建立的方法在确定样品中是否含有大肠埃希菌O157的同时，还能对菌株毒力进行初步判定。成功建立了肠出血性大肠埃希菌O157：H7多重PCR检测方法，为该病原菌感染的预防和监测提供了简便、快速的技术手段，具有良好的应用前景。

肠出血性大肠埃希菌O157：H7；多重PCR；检测；rfbE基因

肠出血性大肠埃希菌O157：H7(EnterohaemorrhagicEscherichiacoliO157：H7,EHEC O157：H7)是一种重要的人兽共患病原菌，首次报道于1982年，由美国Riley L W等[1]发现。随后一些国家也相继发生了散发或暴发性流行，肠出血性大肠埃希菌 O157：H7 对人类健康的危害逐渐引起了各国的普遍关注[2-3]。该菌一般经过动物源性食品传播，感染症状可表现为轻度腹泻、出血性肠炎、溶血性尿毒综合征、血栓性血小板减少性紫癜等[4]，人感染的剂量很低。因此，建立一种快速、灵敏、简便、高效的方法来检测该病原菌极其重要。目前的检测方法主要有免疫学方法(免疫磁珠法、蛋白芯片、蛋白印迹法、胶体金免疫层析试纸)和分子生物学检测方法(PCR法、基因芯片及生物传感技术)等[5-6]，这些方法都有各自的优缺点。其中PCR方法较为成熟，技术上更为先进的实时荧光定量PCR方法也得到广泛的研究，但实时荧光定量PCR需要昂贵的仪器设备，目前还达不到5通道同时检测。而目前已研发的多重PCR检测方法，还不足以对样品中大肠埃希菌O157的毒力和血清型进行同时鉴别。针对这些问题，本研究建立一种快速准确的多重PCR检测方法，该方法针对大肠埃希菌O157的eaeA、fliC、stx1、stx2及rfbE 5种特异性基因设计引物，优化反应条件，并进行实际样品的初步检测。对目的菌有效检出的同时，还能对其毒力进行鉴定，为保证食品安全提供了有效的检测手段。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和培养基 O157：H7 EDL933(NalR)为具有萘啶酮酸抗性的EHEC O157：H7突变株；大肠埃希菌ATCC25922、肺炎克雷伯菌ATCC700603、阴沟肠杆菌ATCC700323、肠炎沙门菌ATCC14028、铜绿假单胞菌ATCC27853、小肠结肠炎耶尔森菌CMCC52204、痢疾志贺菌CMCC51252、粪肠球菌ATCC29212、金黄色葡萄球菌ATCC29213、枯草芽胞杆菌CGMCC1.504、嗜水气单胞菌ATCC7966、蜡样芽胞杆菌ATCC11778、醋酸钙不动杆菌1228c、弗氏柠檬酸杆菌D48、屎肠球菌CO1F7c、嗜麦芽寡养单胞菌5-92、奇异变形杆菌Q1，军事兽医研究所细菌学研究室保存；LB肉汤培养基、LB琼脂培养基、改良EC新生霉素增菌肉汤(mECn)、山梨醇麦康凯琼脂培养基，青岛海博公司产品；CHROMagar大肠埃希菌O157显色培养基，法国科玛嘉公司产品；EHEC O157 O抗原因子血清，天津生物芯片技术有限责任公司产品。

1.1.2 仪器和试剂 T1 PCR仪，德国BioRid公司产品；恒温振荡培养箱为天津欧诺仪器厂生产；细菌基因组提取试剂盒、2×TaqMasterMix试剂，包康世纪公司产品；DNA标准DL 2 000，TaKaRa公司产品。

1.1.3 引物合成 参照文献[7-8]，针对EHEC O157：H7 EDL933株的eaeA、fliC、stx1、stx2、rfbE基因序列合成5对引物。引物由Invitrogen公司合成纯化，序列见表1。

表1 多重 PCR反应引物

1.2 方法

1.2.1 模板制备 将大肠埃希菌O157：H7 EDL933等18种菌株于LB琼脂平板上划线，37℃恒温培养过夜。挑取单菌落接种于LB肉汤培养基中，37℃、180 r/min振荡培养过夜。吸取1 mL新鲜培养菌液，利用细菌基因组提取试剂盒提取基因组DNA，用于PCR扩增。

1.2.2 多重PCR引物浓度的优化 采用正交法对多重PCR中5对引物的添加量进行优化，将5对引物作为5个因素，每个因素设4个水平(引物终浓度为0.1、0.2、0.3、0.4 μmoL/L)，然后进行L16(54)正交试验(表2)。

1.2.3 多重PCR退火温度优化 根据引物退火温度，设计梯度温度PCR扩增程序：94℃ 2 min；94℃ 30 s，退火温度(58、58.5、59、59.7、60.6、61.5、62.5、63.5、64.3、65.1、65.7、66℃)30 s，72℃ 70 s，进行35个循环；72℃ 5 min。

1.2.4 多重PCR的特异性检测 分别以O157：H7 EDL933(NalR)、大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、阴沟肠杆菌、肠炎沙门菌、铜绿假单胞菌、小肠结肠炎耶尔森菌、痢疾志贺菌、粪肠球菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽胞杆菌、嗜水气单胞菌、蜡样芽胞杆菌、醋酸钙不动杆菌、弗氏柠檬酸杆菌、屎肠球菌、嗜麦芽寡养单胞菌及奇异变形杆菌共计18种细菌的基因组DNA为模板，利用最佳多重PCR反应体系和反应条件进行PCR扩增，以验证引物的特异性。

表2 L16(54) 正交试验设计的因素及水平

1.2.5 多重PCR的敏感性检测 将大肠埃希菌O157：H7 EDL933(NalR)过夜培养至对数生长期，然后进行LB平板菌落计数。用无菌生理盐水将菌液按10倍梯度稀释至108，每个梯度吸取1 mL菌液制备PCR模板。按最佳多重PCR反应体系和反应条件进行PCR扩增。

1.2.6 样品检测

1.2.6.1 样品采集 从黑龙江采集犬肛拭子样品61份，吉林德惠某鸡场鸡粪便样品53份，长春周边采集猪肛拭子样品95份、猪粪样品50份及市场采集新鲜猪肉样品46份、鸡肉样品45份和牛肉样品7份，长春某养猪场采集腹泻猪肛拭子样品90份，吉林某种猪场腹泻猪粪便样品44份。

1.2.6.2 样品检测 粪便和鲜肉样品:参考国标(GB/T4789.36-2008)，无菌操作取5 g样品加入到45 mL改良EC新生霉素增菌肉汤(mECn)培养基中，36℃±1℃振荡培养18 h～24 h。

肛拭子样品：在肛拭子试管中加入2.5 mL无菌生理盐水涡旋振荡混匀，取500 μL加入4.5 mL mECn培养基中，37℃振荡培养18 h～24 h。

取上述增菌液100 μL于无菌离心管中，12 000 r/min离心2 min；加入灭菌水100 μL重悬沉淀，沸水浴10 min，冷却后12 000 r/min离心2 min，上清作为PCR模板。按优化的多重PCR反应体系和反应条件进行PCR扩增检测。

1.2.6.3 EHEC O157的分离和鉴定 多重PCR检测阳性样本mECn增菌液于CHROMagar大肠埃希菌O157显色培养基平板划线，37℃培养16 h，挑取典型单菌落于山梨醇麦康凯培养基平板二次纯化，分离获得的疑似大肠埃希菌O157纯培养菌株，用大肠埃希菌O抗原因子血清进行玻片凝集试验以确定其血清型，再进行rfbE基因扩增、测序及BLAST分析。

2 结果

2.1 最适PCR引物浓度

正交试验设计的16种引物浓度组合均能扩增出目的条带，但扩增效果存在差异；其中以组合5的扩增效果最佳(图1)。因此选用组合5为引物最佳使用浓度，即引物E157-F/R、H7-F/R、Stx2-F/R、Stx1-F/R及rfb-EF/R终浓度分别为0.2、0.1、0.2、0.3、0.4 μmoL/L。

优化后的多重PCR反应体系50 μL，包含2×TaqMasterMix 25 μL，E157-F/R引物(10 μmol/L)各1 μL，H7-F/R引物(10 μmol/L)各0.5 μL，Stx2-F/R引物(10 μmol/L)各1 μL，Stx1-F/R引物(10 μmol/L)各1.5 μL，rfbE-F/R引物(10 μmol/L)各2 μL，DNA模板2 μL，灭菌水补足至50 μL。

M.DNA标准DL 2 000;1～16.正交试验号1～16 M.DNA Marker DL 2 000;1-16.Orthogonal test No.1-16

2.2 最适PCR退火温度

12种退火温度的PCR结果显示，温度对多重PCR的影响比较大。当温度升高至62.5℃时，rfbE基因的目的带显现模糊。最后确定 PCR最佳反应条件：94℃ 2 min；94℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 70 s，进行35个循环；72℃ 5 min(图2)。

2.3 多重PCR特异性检测

针对多个不同种属的18种菌株进行了多重PCR扩增。结果显示，肺炎克雷伯菌、阴沟肠杆菌、肠炎沙门菌、铜绿假单胞菌、小肠结肠炎耶尔森菌、痢疾志贺菌、粪肠球菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽胞杆菌、嗜水气单胞菌、蜡样芽胞杆菌、醋酸钙不动杆菌、弗氏柠檬酸杆菌、屎肠球菌、嗜麦芽寡养单胞菌、奇异变形杆菌及大肠埃希菌ATCC25922均无特异性扩增。证明了本试验建立的5对引物多重PCR扩增体系，具有高度的特异性(图3)。

2.4 多重PCR敏感性检测

大肠埃希菌O157：H7 EDL933原始菌液浓度为2.5×108CFU/mL，将2.5×107CFU/mL～2.5 CFU/mL梯度浓度的菌悬液提取DNA后进行多重PCR扩增，结果表明，当模板含量≥5×103CFU时，大肠埃希菌O157：H7均能扩增出对应的目的条带(图4)，多重PCR的敏感性为5×103CFU。

2.5 样品检测

对246份肛拭子样品、147份粪便样品和98份新鲜猪肉样品进行的EHEC O157：H7特异性多重PCR检测结果，检测到2份样品为rfbE基因阳性，其余均为阴性。并且有21份样品检测到fliC基因，6份样品检测到stx1基因，5份样品检测到stx2基因，3份样品检测到eaeA基因，但5个目的基因全部检测到的样品没有检出。

针对rfbE基因阳性的2份样品进行大肠埃希菌的分离，均获得rfbE基因阳性大肠埃希菌分离株(G58和G108)。利用多重PCR对大肠埃希菌G58和G108进行鉴定，均获得rfbE基因目的条带(图5)，但无其他条带。回收目的条带进行测序分析，确认为EHEC O157特异性rfbE基因。经血清学鉴定，大肠埃希菌G58和G108为O157血清型，但属于无志贺毒素和LEE致病岛的弱毒株。血清型鉴定结果与PCR鉴定结果一致。

M.DNA标准DL 2 000;1～12.Tm=58、58.5、59、59.7、60.6、61.5、62.5、63.4、64.3、65.1、65.7、66℃;NC.阴性对照

M.DNA Marker DL 2 000;1-12.Tm=58,58.5,59,59.7,60.6,61.5,62.5,63.4,64.3,65.1,65.7,66℃; NC.Negative control

图2 退火温度对多重PCR扩增的影响

Fig.2 Effect of annealing temperature on multiplex PCR amplification

M.DNA标准DL 2 000;NC.阴性对照；1.大肠埃希菌O157:H7 EDL933;2.肺炎克雷伯菌;3.阴沟肠杆菌;4.肠炎沙门菌;5.铜绿假单胞菌;6.小肠结肠炎耶尔森菌;7.粪肠球菌;8.金黄色葡萄球菌;9.枯草芽胞杆菌;10.蜡样芽胞杆菌;11.醋酸钙不动杆菌;12.屎肠球菌;13.嗜麦芽寡养单胞菌;14.奇异变形杆菌;15.大肠埃希菌;16.痢疾志贺菌;17.嗜水气单胞菌;18.弗氏柠檬酸杆菌

M.DNA Marker DL 2 000; NC.Negative control；1.EscherichiacoliO157:H7 EDL933;2.Klebsiellapneumoniae;3.Enterobactercloacae;4.Salmonellaenteritidis;5.Pseudomonasaeruginosa;6.Yersiniaenterocolitica;7.Enterococcusfaecalis;8.Staphylococcusaureus;9.Bacillussubtilis;10.Bacilluscereus;11.Acinetobactercalcoaceticus;12.Enterococcusfaecium;13.Stenotrophomonasmaltophilia;14.Proteusmirabilis;15.Escherichiacoli;16.Shigelladysenteriae;17.Aeromonashydrophila;18.Citrobacterfreundii

图3 多重PCR特异性检测结果

Fig.3 The results of multiplex PCR specificity test

3 讨论

肠出血性大肠埃希菌O157：H7是一种重要的人畜共患病原菌，流行范围广，致病性强[9-10]，且无疫苗可用。因此，对该病原菌建立完备的检测方法意义重大。

目前，检测肠出血性大肠埃希菌O157：H7的多重PCR方法也有报道[11-12]，但所包含的特异性基因少，不能完全准确地检测到肠出血性大肠埃希菌O157：H7，这给临床检测带来了一定的局限性。本研究为了弥补这一缺陷，建立完善了一种多重PCR检测方法，该方法能够检测EHEC O157：H7 的O抗原血清型特异性基因rfbE和H抗原基因fliC，通过这两个基因确定其血清型，同时还能够检测EHEC O157：H7主要毒力基因eaeA、志贺毒素基因stx1和stx2。这样，在确定受检样品中是否存在EHEC O157：H7 的同时,还能够确定菌株的毒力基因型，从而对其致病性有一个初步判断。

本研究首先优化了多重PCR反应的最佳引物浓度以及退火温度，确立了最优的反应条件，并以此反应条件对该方法的特异性和敏感性进行了检测。特异性试验选取的17种菌，包含革兰阳性菌5种，革兰阴性菌12种，菌属覆盖面广，非目的菌的阴性结果表明，多重PCR反应的特异性较高。敏感性试验结果表明，该方法可以检测到5×103CFU。为了验证该方法的实用性，本研究检测了491份不同来源的样品，包括肛拭子、粪便样品、猪肉样品及牛肉样品等。检测结果全部样品中仅有2份样品rfbE基因阳性，这2份阳性样品均分离得到大肠埃希菌O157。由于携带eaeA基因的LEE致病岛和stx基因的原噬菌体均由可移动遗传原件携带，这一结果说明本地区的大肠埃希菌O157主要以弱毒株或无毒株形式存在，但不排除它们有获得外源毒力基因的可能。总体来说大肠埃希菌O157在这些地区的流行风险并不高。检测结果还发现，一些样品中存在携带eaeA和stx基因的病原菌，很可能为其他血清型的肠出血性大肠埃希菌或肠致病性大肠埃希菌。由于针对携带这些基因的病原菌没有合适的筛选标记因而没有分离获得纯培养的菌株。结果也提示本地区动物性食品有可能受到这类细菌的污染，需要引起重视。

M.DNA标准DL 2 000;1. 5×105拷贝;2. 5×104拷贝;3. 5×103拷贝;4. 5×102拷贝;5. 5×101拷贝;6. 5拷贝;7～9.<1拷贝;NC.阴性对照

M.DNA Marker DL 2 000;1. 5×105copies;2. 5×104copies;3. 5×103copies;4. 5×102copies;5. 5×101copies;6.5copies;7-9.<1copies;NC.Negative control

图4 多重PCR敏感性检测结果

Fig.4 The results of multiplex PCR sensitivity test

M.DNA标准DL 2 000;1.大肠埃希菌O157:H7EDL933;2.大肠埃希菌G58;3.大肠埃希菌G108;NC.阴性对照

M.DNA Marker DL 2 000;1.EscherichiacoliO157:H7EDL933;2.EscherichiacoliG58;3.EscherichiacoliG108;NC.Negative control

图5 猪粪便样品多重PCR检测阳性结果

Fig.5 The positive results of multiplex PCR test for pig fecal samples

多重PCR方法在疾病的临床诊断和流行病学调查研究中是较常见使用的分子生物学检测方法[13-15]。本研究所建立的大肠埃希菌O157：H7 的多重PCR方法，弥补了由于特异性基因少而增加了多重PCR检测结果假阳性的不足，不仅能鉴定出大肠埃希菌O157：H7血清型，还能确定菌株所携带的毒力基因，比以往的大肠埃希菌O157：H7多重PCR检测方法更精准，且特异性和敏感性良好。这种方法对肠出血性大肠埃希菌O157︰H7的疫情防控和流行病学调查具有实际应用价值，值得推广应用。

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Establishment of Multiplex PCR for Detecting EnterohemorrhagicEscherichiacoliO157:H7

JI Xue1,ZHANG Xue1,SUN Yang1,SUN Shi-wen1,ZHU Ling-wei1,LIU Jun1,JIANG Hai-yan2, ZHOU Wei1,LIANG Bing1,GUO Xue-jun1,LIU Yan-jing2

(1.InstituteofMilitaryVeterinaryScience,AMMS,KeyLaboratoryofJilinProvinceforZoonosisPreventionandControl,Changchun,Jilin,130122,China;2.TheAffiliatedHospital,ChangchunUniversityofChineseMedicine,Changchun,Jilin,130021,China)

To establish a rapid and specific multiple PCR method for detection of EnterohemorrhagicEscherichiacoliO157: H7. Five specific genes ofE.coliO157 were selected, such as eaeA gene, fliC gene, the shiga-like toxin gene (stx1, stx2) and rfbE gene.Concentration of primers and annealing temperature were optimized. Specificity and sensitivity of the PCR assay were detected. Practical samples, such as feces, rectal swabs, chicken, beef, pork and rectal swabs of diarrhea pig, were detected. The multiplex PCR assay showed good sensitivity and specificity. Sensitivity of the assay was 5 000 CFU. Strains of EHEC O157 were isolated from the positive samples. The method made an initial estimation of the virulence and whether or not enterohemorrhagicEscherichiacoliO157:H7 was in the samples. The multiplex PCR method for detection of EnterohemorrhagicEscherichiacoliO157: H7 was estabilished successfully. It provided a rapid and simple detecting method for prevention and monitoring of enterohemorrhagicEscherichiacoliO157:H7 with an excellent prospect of application.

EnterohemorrhagicEscherichiacoliO157:H7; multiplex PCR; detection; rfbE Gene

2016-12-02

吉林省自然科学基金项目(20150101110JC，20140101032JC)；武汉市科技计划项目(2014060101010051)

纪 雪(1979-)，女，吉林长春人，实验师，硕士研究生，主要从事分子细菌学研究。*通讯作者

S852.612

A

1007-5038(2017)07-0001-06

研究论文