香樟果挥发性成分不同提取方法的气相色谱－质谱联用分析及其对神经细胞活性的影响

杨锦强，杨念云，于 生，崔小兵，郭舒臣

（南京中医药大学，江苏 南京 210023）

·实验研究·

香樟果挥发性成分不同提取方法的气相色谱－质谱联用分析及其对神经细胞活性的影响

杨锦强，杨念云△，于 生，崔小兵，郭舒臣

（南京中医药大学，江苏 南京 210023）

目的 利用气相色谱－质谱联用（GC－MS）法分析并比较固相微波萃取法与水蒸气蒸馏法提取香樟果中挥发性成分效果，并研究香樟果挥发性成分对神经细胞活性的影响。方法 采用固相微波萃取法、水蒸气蒸馏法提取挥发性成分，GC－MS法分析和鉴定，并用归一化法计算各成分相对百分含量；采用对照法研究水蒸气蒸馏提取的挥发性成分对神经细胞的活性。结果 2种方法提取的香樟果挥发性化学成分有差异。利用固相微波萃取从香樟果中分析鉴定出 26种化学成分，主要成分为 β－侧柏烯（16.07%）、樟脑（14.31%）、3－蒈烯（13.70%）、桉叶油醇（11.53%）和莰烯（5.09%）；利用水蒸气蒸馏从香樟果中分析鉴定出23种化学成分，主要成分为黄樟素（19.81%）、桉叶油醇（9.68%）和芳樟醇（5.88%）。香樟果挥发油质量浓度为100μg／mL时能增强神经细胞活性。结论 2种提取方法得到的香樟果挥发油成分，主要成分差异较大，可根据目标产物的不同采取不同的提取方法。同时，固相微波萃取法提取香樟果挥发性成分，集萃取、进样于一体，操作简单，重复性好，对香樟果的质量控制有应用价值。

香樟果；挥发性成分；气相色谱－质谱联用法；固相微波萃取；水蒸气蒸馏；神经细胞活性

香樟 Cinnamomum camphora也称樟树，系樟科樟属，属于药用植物[1－2]。樟树的树枝、树叶、果实等富含挥发性成分，可芳香健脾。中医学认为，香樟可祛风湿、利关节、行气血，治疗脚气、心腹胀痛、痛风、跌打损伤。目前对于香樟挥发油的研究主要集中在樟树叶[3－4]，后者主要含桉叶素、芳樟醇、α－蒎稀、β－蒎稀、莰烯、黄樟素等挥发性成分。近年来关于香樟果挥发性成分的研究较少，而香樟果为可再生资源，应用前景广阔。为此，本试验中采用气相色谱－质谱联用（GC－MS）法对比分析了固相微波萃取法和水蒸气蒸馏法提取的香樟果挥发性成分及其相对含量，为进一步研究提供科学依据。同时，本试验中还研究了水蒸气蒸馏法提取的香樟果挥发性成分对神经细胞活性的影响[5]。现报道如下。

1 材料与方法

1.1 仪器与试药

1.1.1 仪器

Agilent 7890B／7000C型气相色谱－质谱联用仪，Agilent Technologies 7697A型自动固相微萃取装置（美国Agilent公司）。

1.1.2 试药

试剂用水为超纯水；甲醇（南京化学试剂股份有限公司）为色谱纯；大鼠C6胶质瘤细胞（广州赛业生物科技有限公司）。香樟果于2016年11月采自南京中医药大学，自然阴干，所有样品均经南京中医药大学杨念云副研究员鉴定，标本保存于南京中医药大学生药学实验室。

1.2 方法

1.2.1 固相微波萃取法

称取2 g香樟果（经粉碎），置15mL专用采样瓶中，插入自动进样器，90℃下顶空萃取保持30min，自动插入色谱仪进样口（温度250℃）中，脱附1.5min。

1.2.2 水蒸气蒸馏法

称取1 000 g香樟果（经粉碎），置5 000mL圆底烧瓶中，水蒸气蒸馏2 h，收集挥发油（无色，有特殊香味）并取0.5m L以甲醇溶解。

1.2.3 GC－MS法

毛细管气相色谱－质谱联用仪器。气相条件，HP－5MS石英毛细管柱（30 m×0.25 mm，0.25μm），柱温60℃（保持2min），以5℃／min的速率升温至120℃，保持2min，再以5℃／min的速率升温至280℃；进样口温度250℃；载气为高纯度He（99.999%），载气流速1 mL／min；进样量1μL，采用不分流方式进样；溶剂延迟3min。质谱条件，电离方式为电子轰击电离（EI），电子能量70 eV，离子源温度230℃，接口温度280℃，扫描质量范围 m／z30～500。

1.2.4 神经细胞活性试验

采用含双抗和5%胎牛血清的DMEM细胞培养基，于 37℃及 5%CO2培养箱中培养。每次传代均以0.25%胰酶消化，洗涤1次，更换新培养基。传代浓度为5×105／m L。将细胞分为正常对照组、溶剂对照组（含0.1%二甲基亚砜的DMEM培养液）及不同质量浓度（25，100μg／m L）香樟挥发油给药组，继续培养24 h。采用酶联免疫吸附试验（ELISA）试剂盒法，于酶标仪450 nm波长处测定吸光度值，根据标准曲线计算各组细胞上清液中神经生长因子（NGF）的含量。

2 结果

通过以上试验，分别得到不同方法的总色谱谱图和质谱数据。通过工作站NIST标准质谱图库和相关文献[6－12]报道分析，鉴定出部分化合物。通过工作站对数据进行处理，按照峰面积归一化法计算各化合物的相对百分含量，结果见表1。神经细胞活性试验结果见表2。

由表1可见，固相微波萃取法提取的挥发性成分共分离出32个色谱峰，其中鉴定出了26个化合物，占总挥发性峰面积的87.01%。其中以不饱和烃（45.80%）和醚类（19.23%）为主，主要成分（相对百分含量＞5%）为 β－侧柏烯（16.07%）、樟脑（14.31%）、3－蒈烯（13.70%）、桉叶油醇（11.53%）和莰烯（5.09%）。水蒸气蒸馏法提取的挥发性成分共分离出32个色谱峰，其中鉴定出了23个化合物，占挥发性组分峰面积的58.88%，其中以醚（31.77%）和不饱和烃（16.10%）为主，主要成分为黄樟素（19.81%）、桉叶油醇（9.68%）和芳樟醇（5.88%）。

表1 固相萃取香樟果挥发性成分的GC－MS分析

续表1 固相萃取香樟果挥发性成分的GC－MS分析

表2 神经细胞活性比较

由表2可见，香樟果挥发性成分质量浓度为100μg／mL时能增强神经细胞活性。

3 讨论

由鉴定出来的成分可见，2种方法得到的挥发油成分中，有14种化合物是2种提取方法得到的挥发油共有的，分别占 52.55%（固相微波萃取法）和52.50%（水蒸气蒸馏法）。但提取的挥发油主要成分有明显差异，固相微波萃取法得到的挥发油中β－侧柏烯、3－蒈烯含量明显高于水蒸气蒸馏法得到的挥发油中的此类成分，而水蒸气蒸馏法得到的挥发油中黄樟素的含量明显高于固相微波萃取法得到的挥发油中的此类成分。

樟脑是世界上最早使用的天然有机化学成分之一，有兴奋、强心、消炎、镇痛、抗菌、止咳、促渗、杀螨等药理作用[13]。通过固相微波萃取法可得到较高含量的樟脑。黄樟素是白鼠和老鼠的致肝癌物，鉴于此，美国不允许将其作为食品添加剂[14－15]。通过水蒸气蒸馏法提取的挥发油成分中，黄樟素的含量明显降低。桉叶油醇对马铃薯茎蛾具有明显的产卵引诱，对于马铃薯茎蛾的防治有着重要意义[16]。本研究中2种方法提取的挥发油中桉叶油醇的含量均较高。

本研究中分析并比较了固相微波萃取法和水蒸气蒸馏法提取得到的香樟果挥发油的成分，主要成分差异较大，可根据目标产物的不同采取不同的提取方法，为药理研究和合理利用香樟果资源提供科学依据，研究同时发现，香樟果挥发油能增强神经细胞的活性。此外，本研究中笔者首次采用固相微波萃取法提取香樟果挥发性成分，集萃取、进样于一体，操作简单，重复性好，对于香樟果的质量控制具有参考意义。

[1]王中生.樟科观赏树种资源及园林应用[J].中国野生植物资源，2001，20（4）：31－33.

[2]陶光复.湖北樟属植物资源[J].武汉植物学研究，2001，19（6）：489－496.

[3]Sun CL，Huang KY，Chen CJ，etal.Analysis of chemical composition of volatile oil in Cinnamomum camphora leaves and branches by GC－MS[J].Flavour Fragrance Cosmetic，2007（1）：7－9.

[4]周 翔，莫建光，谢一兴，等.广西芳樟醇型樟树精油成分的GC－MS研究[J].食品科技，2011，36（1）：282－285.

[5]缪 兵，高建新，刘星霞，等.银杏内酯B对神经细胞活性影响的实验研究[J].山东医药，2004，44（20）17－18.

[6]Chalchat JC，Valade I.Chemical composition of leaf oils of Cinnamomum from Madagascar：C.zeylanicum Blume，C.camphora L，C.fragrans Baillon and C.angustifolium [J].J Essent Oil Res，2000，12（5）：537－540.

[7]李林松，罗永明.井冈山地区樟树果挥发性成分的分析[J].江西中医学院学报，2005，17（3）：36－37.

[8]王 ，张党权，章怀云，等.樟树叶化学成分的GC－MS分析[J].中南林业科技大学学报(自然科学版)，2010，30（10）：117－120.

[9]陈小兰，曾红高，谢正平，等.龙脑樟叶部精油在不同蒸馏时段的出油率和化学成分[J].江西林业科技，2011（3）：1－2.

[10]吴学文，熊 艳，游奎一.樟树叶挥发性成分研究[J].广西植物，2011，31（1）139－142.

[11]孙崇鲁，汤小蕾，周静峰，等.香樟叶化学成分的研究[J].天然产物研究与开发，2014，26（11）：1793－1796.

[12]徐 晶，张在龙，王 兵，等.香樟不同部位脂溶性成分的GC－MS分析[J].中国实验方剂学杂志，2014，20（7）：50－53.

[13]丁元刚，马红梅，张伯礼.樟脑药理毒理研究回顾及安全性研究展望[J].中国药物警戒，2012，9（1）：38－42.

[14]韩 熠，张承明，喻 坤，等.食品及化妆品种香豆素和黄樟素类化合物分析方法研究进展[J].香料香精化妆品，2013（1）：45－49.

[15]U.S.Food and Drug Administration.Code of federal Regulations－Title 21－Food and Drugs[EB／OL].[2012－06－18].http：／／www.fda.gov.

[16]康 敏，谭仲夏，任静涛，等.印楝素和桉叶油醇对马铃薯块茎蛾产卵选择性的影响[J].安徽农学通报，2007，13（3）：134－145.

Volatile O ils of Fruits of Cinnamomum Cam phora w ith Different Extraction M ethods by GC－M S and Its Effect on Nerve Cell Activity

Yang Jinqiang，Yang Nianyun，Yu Sheng，Cui Xiaobing，Guo Shuchen
（Nanjing University of Chinese Medicine，Nanjing，Jiangsu，China 210023）

Objective To analyze and compare the methods of solid－phase microextraction（SPME）and steam distillation for extracting volatile oils from fruits of Cinnamomum Camphora by GC－MS and to study its effect on nerve cell activity.M ethods The volatile oils were extracted by SPME and steam distillation，analyzed and identified by GC－MS.The compounds were quantitatively determined by normalization method.The effect of volatile oils extracted by steam distillation on nerve cell activity was study by contrast method.Resu lts The main volatile compounds extracted from fruits of Cinnamomum Camphora by the 2 methods were different.Totally 26 compounds were identified by SPME from fruits of Cinnamomum Camphora.The major chemical constituents wereβ－thujene （16.07%），camphor（14.31%），3－carene（13.70%），eucalyptol（11.53%）and camphene（5.09%）.Totally 23 compounds were identified by steam distillation from fruits of Cinnamomum Camphora.The major chemical constituents were safrole（19.81%），eucalyptol（9.68%）and linalool（5.88%）.The volatile oils at the concentration of 100μg／m L could enhance the activity of nerve cells.Conclusion The main volatile compounds extracted from fruits of Cinnamomum Camphora by the 2 methods were different，different extraction methods can be adopted according to different target products.Meanwhile，the extraction of volatile components of Cinnamomum Camphora by SPME is a combination of extraction and sample introduction.It has simple operation，good repeatability，and practical value for the quality control of Cinnamomum Camphora.

Cinnamomum Camphora；volatile oil；GC－MS；SPME；steam distillation；nerve cell activity

R284.1；R285.5；R282.71

：A

：1006－4931(2017)12－0023－04

10.3969／j.issn.1006－4931.2017.12.006

杨锦强，在读硕士研究生，研究方向为天然药物生产加工与品质评价，（电子信箱）13770676634＠163.com。

△通讯作者：杨念云，副研究员，硕士研究生导师，主要从事中药天然药物资源化学研究，（电子信箱）nianyunyang＠163.com。

2017－01－06；

2017－02－07)