Bt基因导入对侵染丛枝菌根真菌的玉米生长生理及磷转运基因表达的影响*

钟 旺, 曾慧兰,2, 王建武**



Bt基因导入对侵染丛枝菌根真菌的玉米生长生理及磷转运基因表达的影响*

钟 旺1, 曾慧兰1,2, 王建武1**

(1. 华南农业大学资源环境学院/农业部华南热带农业环境重点实验室/广东省现代生态循环农业工程中心 广州 510642; 2.惠州市园林管理局 惠州 516000)

为了分析Bt玉米与常规玉米对接种丛枝菌根真菌响应的异同, 本文在接种摩西球囊霉()和不接种的条件下, 对比分析了两个Bt玉米品种‘5422Bt1’(Bt11)和‘5422CBCL’(Mon810)以及同源常规玉米品种‘5422’根系中丛枝菌根真菌侵染率、磷转运基因的表达量、生长和养分利用状况。结果表明: 生长50 d和80 d时, Bt玉米‘5422Bt1’和‘5422CBCL’根系丛枝菌根真菌侵染率显著高于常规玉米‘5422’, 分别比‘5422’高13.54%、11.24%和9.83%、6.70%; 50 d取样时, 接菌和不接菌处理玉米‘5422Bt1’、‘5422CBCL’和‘5422’根系内的磷转运基因表达量均没有显著差异; 接菌和不接菌处理下玉米‘5422Bt1’的干重显著高于‘5422CBCL’相应的处理, 而与‘5422’没有显著差异; 80 d取样时, 不接菌处理玉米‘5422Bt1’的根长、根表面积和根体积显著高于‘5422’和‘5422CBCL’不接菌处理。Bt基因的导入主要影响了两个Bt玉米品种(‘5422Bt1’和‘5422CBCL’)苗期(50 d)和成熟期(80 d)的氮素吸收利用, 与常规玉米品种‘5422’相比, 合成Bt蛋白消耗了部分氮素和磷; 3个玉米品种对接种AMF的响应不同, 接菌处理提高了‘5422Bt1’和‘5422CBCL’苗期(50 d)和成熟期(80 d)的氮素吸收利用。在磷养分条件满足玉米生长需要的条件下, 接种丛枝菌根真菌对Bt玉米磷转运基因表达量和磷的吸收利用没有显著影响。Bt基因的导入以及接种对Bt玉米生长和养分利用的影响与不同转化事件形成的品种特性相关。

Bt玉米; 丛枝菌根真菌; 生长特性; 养分利用; 磷转运基因

丛枝菌根真菌(arbuscular mycorrhizal fungi, AMF)是土壤中一类有益的真核微生物, 可与80%以上的陆地植物根系形成互惠共生关系[1-2]。可促进植物对土壤水分、矿质元素等的吸收, 进而促进宿主植物的生长发育, 提高植物耐盐、耐旱、耐重金属和抗病的能力[3-6]。但是这类有益真菌却很容易受到宿主植物的影响[7]。

Bt()玉米()是全球商品化最快的抗虫转基因作物之一, 2015年全球转基因玉米种植面积高达539.1万hm2[8], 其根系能够分泌有杀虫活性的Bt蛋白, 且在土壤中可以保持杀虫活性180 d以上[9], 可能影响玉米与AMF的共生关系[10]。国内外已有Bt玉米对AMF侵染影响的研究报道, 但其结果不一致。Cheeke等[11-12]通过盆栽接种AMF发现Bt玉米AMF的侵染率显著低于常规玉米, 但Bt基因的导入并未影响玉米的生长; Seres等[13]也通过田间试验发现Bt玉米AMF的侵染率显著低于常规玉米。任禛等[14]盆栽接种摩西球囊霉(,原为)发现Bt玉米的侵染率显著高于常规玉米, 接种AMF对Bt玉米生长的促进效应显著高于常规玉米; Zeng等[15]也在田间连续种植5季Bt玉米和常规玉米后发现, Bt玉米AMF侵染率显著高于常规玉米。冯远娇等[16]通过温室盆栽试验发现, Bt基因的导入并未影响玉米AMF的侵染率, 而玉米的养分含量与培育Bt玉米品种的不同转化事件有关; Cheeke等[17-19]也通过田间试验表明Bt基因的导入并未影响玉米AMF侵染率, 也未对Bt玉米的生长产生影响。上述研究仅关注了Bt基因导入对玉米AMF的侵染率和生长的影响, 尚未深入探讨其变化的分子生物学机理。AMF能够促进植物对矿质元素特别是磷的吸收[4,20], 磷转运基因;是植物根系吸收、利用磷的关键调控基因[21], 接种AMF是否会诱导Bt玉米根系磷转运基因;的表达？Bt基因的导入是否也会影响该基因的表达呢？

由美国Beck’s Superior Hybrids公司生产的‘5422Bt1’(Bt11)和‘5422CBCL’(Mon810)是美国商品化程度很高的Bt玉米品种, 许多研究者把它作为Bt玉米生态风险评估的对象[14-16]。摩西球囊霉为田间侵染玉米根系的主要菌种[15,17]。在玉米播种50 d时, 植株生长最为旺盛, 此时取样能初步反映出处理因素对玉米的影响[22]; 而在80 d时, 玉米基本完成了营养生长, 此时取样最能反映出处理因素对玉米的影响[23]。因此本试验以摩西球囊霉为接种菌剂, 对比研究了两个不同转化事件的Bt玉米[‘5422Bt1’ (Bt11)和‘5422CBCL’(Mon810)]及其共同的同源常规玉米品系‘5422’在接种摩西球囊霉和不接种的条件下, 生长50 d和80 d时根系的AMF侵染率和磷转运基因;表达的变化以及生长及养分利用的差异, 旨在为Bt玉米的生物安全管理提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

Bt玉米品种‘5422Bt1’(Bt11)和‘5422CBCL’ (MON810)及其同源常规玉米品种‘5422’均来自美国Beck’s Superior Hybrids公司, 由Purdue大学农学系Cindy Nakatus博士惠赠; 两种Bt玉米品种表达的杀虫蛋白均为Cry1Ab。

供试菌剂为中国科学院“丛枝菌根真菌种质资源库”的摩西球囊霉, 由华南农业大学园艺学院姚青老师提供的保存在玉米上的摩西球囊霉的孢子、菌根根段和菌丝作为接种剂, 经玉米扩繁后供试验所用。供试所用土壤均为河沙, 河沙经2 mm筛后, 干热灭菌(180 ℃, 2 h)后备用。

1.2 试验设计

接种试验于2014年6月8日在华南农业大学温室大棚内进行, 每个供试玉米品系设接种摩西球囊霉菌剂()和不接菌剂两个处理。塑料盆(高15 cm, 口径16.5 cm)使用0.1%高锰酸钾溶液浸泡24 h后晾干, 先装1.5 kg灭菌河沙, 然后铺盖100 g摩西球囊霉菌剂。每个品系选取饱满、大小一致的种子(经10% H2O2预处理5 min)播种再用0.5 kg河沙覆盖, 最后淋透水供玉米发芽生长。每隔3 d施一次Hoagland营养液, 并按生长需要补充水分。每盆种1株, 每个处理各种20株。待玉米生长至50 d和80 d时每个重复各取样3株并测定菌根侵染率及各项生理指标。

1.3 指标的测定

1.3.1 根系AMF侵染率的测定

每个重复随机选取30条直径为1 mm的根系洗净放入种苗瓶中, 曲利苯蓝染色后制片, 镜检。根据根段中菌根侵染(0、<1%、<10%、<50%、>50%和>90%)的标准, 定义每一条根, 用“Mycocalc”软件计算出AMF侵染率[24]。

1.3.2 磷转运基因表达的测定

每个重复取100 mg玉米根系, 使用RNAprep Pure Plant Kit试剂盒(Tiangen, Beijing)提取根系总RNA, 然后用PrimeScriptTM RT Master Mix (Perfect Real Time)试剂盒(Takara, Dalian)进行反转录, 再使用SuperReal PreMix Plus (SYBR Green)试剂盒(Tiangen, Beijing)进行qRT-PCR, 反应液配制如下: 1 μL cDNA模板, 10 μL 2-fold SuperReal PreMix Plus (SYBR Green), Forward引物(5′-CCGTCAACAACA TGGTGACA GG-3′) 0.6 μL, Reverse引物(5′-AGAAGCGGAAGAAGCAGAGCGT-3′) 0.6 μL, 加RNase-free water至20 μL。反应条件为: 预变性95 ℃15 min, 变性95 ℃ 30 s, 退火60 ℃ 30 s, 延伸72 ℃ 30 s, 40个循环。采用相对定量的方法计算基因;的表达[21]。

1.3.3 生长指标的测定

测量玉米茎基部到顶部的高度为株高。根系生长特性的测定采用EPSON V700双光源专用扫描仪对根系扫描, 用根系图像分析软件WinRHIZO REG 2009分析扫描图片, 得出根系长度、根系表面积和根系体积等指标[25]。再将玉米植株放进烘箱于105 ℃杀青30 min后, 于75 ℃恒温烘干, 然后分别称取地上部和地下部生物量。

1.3.4 养分含量的测定

玉米叶片和根系中有机碳、全氮、全磷和全钾含量的测定参照鲍士旦的方法[26]。

1.4 统计分析

所有数据采用SPSS 13.0软件进行统计分析, 不同品种多处理间差异采用单因素方差分析(one-way ANOVA)和Duncan多重比较, 接种AMF和不接种处理间差异显著性检验用成组数据的检验, 差异显著性水平为0.05。图表中数据为平均值±标准误。

2 结果与分析

2.1 玉米根系AMF侵染率和磷转运基因表达量

两个取样时间接菌处理Bt玉米品种‘5422CBCL’和‘5422Bt1’AMF的侵染率均显著高于常规玉米‘5422’, 分别比‘5422’高13.54%、11.24%和9.83%、6.70%(图1), 这与Zeng等[15]和任禛等[14]的研究结果一致; 而与Cheeke等[11]的Bt基因导入降低了玉米AMF侵染率的研究结果不一致。本试验选用的Bt玉米品种与Zeng等[15]和任禛等[14]的相同, 但与Cheeke等[11]所选用的Bt玉米品种(Bt11)不同, 可见, 玉米AMF侵染率的大小与供试品种相关。

是一种高亲和力的磷转运基因, 能够增加植物吸收磷的效率, 其表达量经常受AMF诱导[2,27]。虽然Bt基因的导入会改变植株体内的部分生理代谢[28], 但50 d取样时, Bt玉米‘5422Bt1’(Bt11)和‘5422CBCL’(Mon810)与常规玉米‘5422’间的磷转运基因表达量却没有显著差异, ‘5422’、‘5422Bt1’(Bt11)和‘5422CBCL’ (Mon810)玉米的磷转运基因的表达量在接菌与不接菌处理间也没有显著差异(图1b)。这与Saia等[29]的在施肥条件下接种AMF未促进Pt1基因表达的研究结果一致, 说明玉米根系吸收的磷能够满足玉米自身生长需要, 不需要再由菌丝诱导磷转运基因的表达来提高磷的吸收。

‘5422Bt1’和‘5422CBCL’为Bt玉米品种, ‘5422’为同源常规玉米品种。同一取样时间不同字母表示品种间差异显著(<0.05)。‘5422Bt1’ and ‘5422CBCL’ are Bt corn varieties, ‘5422’ is conventional corn variety. Different letters at the same sampling time mean significant differences among varieties at 0.05 level.

2.2 摩西球囊霉侵染对Bt玉米生长和养分利用的影响

2.2.1 对玉米株高和生物量的影响

株高和生物量是评价植物生长的重要指标。50 d取样时, 不接菌处理的3个玉米品种的株高、全株干重和地下部干重没有显著差异, 仅‘5422Bt1’的地上部干重显著高于‘5422CBCL’(表1)。接菌处理后, ‘5422’的株高显著高于其不接菌处理, 且显著高于‘5422CBCL’和‘5422Bt1’接菌处理(表1); ‘5422Bt1’的全株、地上部和地下部干重显著高于‘5422CBCL’ (表1)。80 d取样时, ‘5422’、‘5422Bt1’和‘5422CBCL’的株高、全株干重和地上部干重在所有处理间均没有显著差异(表1), 仅地下部干重存在显著差异: 不接菌处理‘5422Bt1’>‘5422’和‘5422CBCL’, 接菌处理‘5422Bt1’和‘5422CBCL’显著低于其不接菌处理, 接菌处理‘5422Bt1’>工人‘5422CBCL’。

上述结果说明, Bt基因的导入对玉米品种的生长特性有一定的影响, 表现在地上部干重(50 d)和地下部干重(80 d)的差异; Bt基因的导入也影响了玉米品种对接种AMF的响应, 接菌处理苗期(50 d)对‘5422’株高的促进作用强于‘5422Bt1’和‘5422CBCL’, 对‘5422Bt1’全株干重、地上部干重的促进作用强于‘5422CBCL’, 这与Cheeke等[17]的研究结论一致。

表1 摩西球囊霉侵染对Bt玉米株高和干重的影响

‘5422Bt1’和‘5422CBCL’为Bt玉米品种, ‘5422’为同源常规玉米品种。同列同一取样时间不同字母表示差异显著(<0.05), 同行星号(*)表示在接菌处理(+G)与不接菌处理(-G)平均值间差异显著(<0.05)。‘5422Bt1’ and ‘5422CBCL’ are Bt corn varieties, ‘5422’ is conventional corn variety. Different letters in the same column at the same sampling time mean significant differences among varieties at 0.05 level. In the same row, star (*) means significant difference at 0.05 level between averages of inoculation (+G) and non-inoculation (-G) treatments.

2.2.2 对玉米根系生长特性的影响

根系是植物的主要吸收器官, 植物依靠根系从土壤中吸收水分和无机盐。根系长度和密度对植物的生长起着重要作用。50 d取样时, 所有处理‘5422’、‘5422Bt1’和‘5422CBCL’玉米的根长、根表面积和根体积均没有显著差异(表2), 说明Bt基因导入与接菌处理均没有影响苗期玉米的根系生长特征。80 d取样时, 不接菌处理‘5422Bt1’玉米的根长、根表面积和根体积显著高于‘5422’和‘5422CBCL’(表2), 说明Bt11基因的导入提高了‘5422Bt1’玉米成熟期(80 d)的根系活力; 但接菌处理并没有促进其根系生长。

表2 摩西球囊霉侵染对Bt玉米根系生长特性的影响

‘5422Bt1’和‘5422CBCL’为Bt玉米品种, ‘5422’为同源常规玉米品种。同列同一取样时间不同字母表示差异显著(<0.05), 同行星号(*)表示在接菌处理(+G)与不接菌处理(-G)平均值间差异显著(<0.05)。‘5422Bt1’ and ‘5422CBCL’ are Bt corn varieties, ‘5422’ is conventional corn variety. Different letters in the same column at the same sampling time mean significant differences among varieties at 0.05 level. In the same row, star (*) means significant difference at 0.05 level between averages of inoculation (+G) and non-inoculation (-G) treatments.

2.2.3 对玉米养分含量的影响

氮、磷、钾和有机碳含量是评价植物养分利用的重要指标。50 d取样不接菌处理下, ‘5422Bt1’的全株全氮含量显著高于‘5422CBCL’, 其地下部全氮含量也显著高于‘5422’和‘5422CBCL’, 但3个玉米品种全株、地上部和地下部的全磷、全钾和有机碳含量没有显著差异(表3)。50 d取样接菌处理下, 3个玉米品种, 仅‘5422Bt1’地下部全氮显著低于‘5422CBCL’、全磷含量显著低于‘5422’和‘5422CBCL’, ‘5422CBCL’地上部全钾含量显著高于‘5422’(表3); ‘5422Bt1’接菌处理仅地下部全氮含量低于其不接菌处理, 其全株和地上部全氮含量显著低于其不接菌处理, ‘5422CBCL’接菌处理全株和地下部全氮含量显著高于其不接菌处理(表3)。

80 d取样不接菌处理下, ‘5422’的全株和地上部全氮含量、全株全磷含量显著高于‘5422CBCL’, 地下部全磷含量、全株全钾含量也显著高于‘5422Bt1’和‘5422CBCL’, 地下部全钾含量也显著高于‘5422Bt1’(表3)。80 d取样接菌处理下, 3个玉米品种之间仅‘5422’全株有机碳含量显著低于‘5422Bt1’和‘5422CBCL’; ‘5422CBCL’玉米的全株全氮含量显著高于其不接菌处理, 全株有机碳含量显著低于不接菌处理。

上述结果表明, Bt基因的导入主要影响了两个Bt玉米品种(‘5422Bt1’和‘5422CBCL’)苗期(50 d)和成熟期(80 d)的氮素吸收利用, 与常规玉米品种‘5422’相比, 合成Bt蛋白消耗了部分氮素和磷; 3个玉米品种对接种AMF的响应不同, 接菌处理提高了‘5422Bt1’和‘5422CBCL’苗期(50 d)和成熟期(80 d)的氮素吸收利用。

3 讨论与结论

本研究表明, Bt基因的导入影响了供试的两个转Bt玉米品种的生长特性及其对接种AMF的响应, 且这种影响与导入Bt基因的转化事件相关, 这与Cheeke等[17]的研究结论一致。菌根侵染状况是反映植物与真菌之间共生亲和力的重要指标[14]。‘5422Bt1’(Bt11)和‘5422CBCL’(Mon810)玉米根系AMF侵染率显著高于常规玉米‘5422’, 接菌处理苗期(50 d)对‘5422’株高的促进作用强于‘5422Bt1’和‘5422CBCL’; 对‘5422Bt1’全株干重、地上部干重的促进作用强于‘5422CBCL’。Bt11基因的导入提高了‘5422Bt1’玉米成熟期(80 d)的根系活力; 但接菌处理并没有促进其根系生长。Bt基因的导入主要影响了两个Bt玉米品种苗期和成熟期的氮素吸收利用, 与常规玉米品种‘5422’相比, 合成Bt蛋白消耗了部分氮素和磷, 这与冯远娇等[16]的研究结果一致。3个玉米品种对接种AMF的响应不同, 接菌处理提高了‘5422Bt1’和‘5422CBCL’苗期和成熟期的氮素吸收利用, 但没有影响玉米的磷转运基因的表达量以及玉米对磷素的吸收利用, 这与任禛等[14]、贾广军等[30]和付先恒等[31]的研究结果不一致, 可能是在本试验中每隔3 d添加一次Hoagland营养液, 土壤中磷素养分充足, 能满足玉米生长需要, 不需要AMF再提高其吸收量[32]。

综上所述, Bt基因的导入促进了AMF对玉米的侵染, 而对玉米中磷转运基因表达没有影响, 同时Bt基因的导入对玉米生长和养分利用的影响与不同转化事件形成的品种特性有关, 玉米‘5422Bt1’的干重显著高于‘5422CBCL’, 而与‘5422’没有显著差异;玉米‘5422Bt1’的根长、根表面积和根体积显著高于‘5422’和‘5422CBCL’; 玉米‘5422’的全氮、全磷和全钾显著高于‘5422CBCL’, 而与‘5422Bt1’没有显著差异; 3个玉米品种对接种AMF的响应不同, 接菌处理提高了‘5422Bt1’和‘5422CBCL’苗期和成熟期的氮素吸收利用。

表3 摩西球囊霉侵染对Bt玉米养分含量的影响

‘5422Bt1’和‘5422CBCL’为Bt玉米品种, ‘5422’为同源常规玉米品种。同列同一取样时间不同字母表示差异显著(<0.05), 同行星号(*)表示在接菌处理(+G)与不接菌处理(-G)平均值间差异显著(<0.05)。‘5422Bt1’ and ‘5422CBCL’ are Bt corn varieties, ‘5422’ is conventional corn variety. Different letters in the same column at the same sampling time mean significant differences among varieties at 0.05 level. In the same row, star (*) means significant difference at 0.05 level between averages of inoculation (+G) and non-inoculation (-G) treatments.

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Effect of Bt gene insertion on growth, physiology and gene expression of phosphorus transporter gene of corn after arbuscular mycorrhizal fungi colonization*

ZHONG Wang1, ZENG Huilan1,2, WANG Jianwu1**

(1. College of Natural Resources and Environment, South China Agricultural University / Key Laboratory of Agro-environment in the Tropics, Ministry of Agriculture, South China Agricultural University / Guangdong Engineering Research Center for Modern Eco-agriculture and Circular Agriculture, Guangzhou 510642, China; 2. Huizhou Landscaping Administration Bureau, Huizhou 516000, China)

Bt ()-corn root can exudate insecticide active Bt protein and persistent toxin in soils which can affect symbiotic relationship between corn and arbuscular mycorrhizal fungi (AMF). In this paper, two Bt-corn varieties ‘5422Bt1’ (Bt11) and ‘5422CBCL’ (Mon810), and one conventional corn variety ‘5422’ were used to explore the difference between Bt and non-Bt varieties withinoculation and non-inoculation treatments. The colonization of AMF, phosphorus transporter gene expression, growth and nutrients contents were measured after 50 d and 80 d of inoculation. The results showed that AMF colonization of Bt-corn varieties ‘5422Bt1’ and ‘5422CBCL’ were significantly higher than that of the conventional variety ‘5422’ at 50 d and 80 d after treatment, which increased by 13.54% and 11.24% at 50 d and then by 9.83% and 6.70% at 80 d, respectively. There was no significant difference in phosphorus transporter gene expression between inoculation and non-inoculation for Bt-corn varieties at 50 d. The height of ‘5422’ under inoculation treatment was significantly higher than that of ‘5422Bt1’ and ‘5422CBCL’ at 50 d. Dry weight of ‘5422Bt1’ under inoculation treatment was significantly higher than that of ‘5422CBCL’ at 50 d. The root length, root surface and root volume of ‘5422Bt1’ were significantly higher than those of ‘5422’ and ‘5422CBCL’ under non-inoculation treatments at 80 d. Bt gene insertion affected nitrogen concentration of the two Bt-corn varieties (‘5422Bt1’and ‘5422CBCL’) at the two sampling times. As compared with conventional corn variety, the two Bt-corn varieties needed more nitrogen and phosphorus to synthetize Bt protein. There were significant differences among the responses of three corn varieties to AMF inoculation.inoculation significantly increased nitrogen absorption of‘5422Bt1’ and ‘5422CBCL’ at the two sampling times (50 d and 80 d). In conclusion, the effect of Bt-gene insertion and AMF inoculation on growth and nutrient utilization of Bt-corn was mainly dependent on its transformation event.

Bt-corn; Arbuscular mycorrhizal fungi; Growth characteristics; Nutrient utilization; Phosphorus transporter gene

10.13930/j.cnki.cjea.170065

S154.36; S513

A

1671-3990(2017)08-1198-08

* 国家自然科学基金项目(31470574, 31170506)资助

**通讯作者:王建武, 主要从事转基因作物的生态风险评估。E-mail: wangjw@scau.edu.cn

钟旺, 主要从事转基因玉米的生态风险评估。E-mail: m15018483675_1@163.com

2017-01-18 接受日期: 2017-03-30

* This study was founded by the National Natural Science Foundation of China (31470574, 31170506).

, E-mail: wangjw@scau.edu.cn

Jan. 18, 2017; accepted Mar. 30, 2017

钟旺, 曾慧兰, 王建武. Bt基因导入对侵染丛枝菌根真菌的玉米生长生理及磷转运基因表达的影响[J]. 中国生态农业学报, 2017, 25(8): 1198-1205

Zhong W, Zeng H L, Wang J W. Effect of Bt gene insertion on growth, physiology and gene expression of phosphorus transporter gene of corn after arbuscular mycorrhizal fungi colonization[J]. Chinese Journal of Eco-Agriculture, 2017, 25(8): 1198-1205