慢性阻塞性肺疾病患者外周血单个核细胞NOD2 mRNA表达及白细胞介素-6的水平及意义

贾钦尧 陈绍平 李新胜 宋 珊 毛 建 韩美玲

(川北医学院附属医院呼吸内科，四川 南充 637000)



慢性阻塞性肺疾病患者外周血单个核细胞NOD2 mRNA表达及白细胞介素-6的水平及意义

贾钦尧 陈绍平 李新胜 宋 珊 毛 建 韩美玲

(川北医学院附属医院呼吸内科，四川 南充 637000)

目的 探讨外周血单个核细胞NOD2 mRNA和血清白细胞介素(IL)-6在慢性阻塞性肺疾病(COPD)发病机制中的作用及其与COPD患者严重程度的关系。方法 对经过门诊及住院达到稳定期的COPD患者进行综合评估，分为A、B、C、D四组，每组30例，同期门诊健康体检者30例作为健康对照组，采用PCR和ELISA法分别检测COPD各组及健康对照组外周血单个核细胞核内NOD2 mRNA的表达及血清中IL-6的含量。结果 COPD稳定期患者外周血单个核细胞核内NOD2 mRNA及血清IL-6的表达均明显高于健康对照组(P<0.05)。COPD患者A、B、C、D各组中NOD2 mRNA和IL-6的表达明显高于健康对照组(P<0.05)。COPD患者D组NOD2 mRNA和IL-6的表达明显高于C组(P<0.05)，C组和D组的NOD2 mRNA和IL-6的表达均明显高于A组和B组(P<0.05)，A组和B组之间无统计学差异(P>0.05)。COPD患者NOD2 mRNA表达和IL-6的含量呈正相关(r=0.81，P<0.05)。结论 NOD2 和IL-6都参与了COPD气道炎症的发生发展，其水平与COPD患者严重程度呈正相关。

慢性阻塞性肺疾病；NOD2；白细胞介素

NOD样受体(NLRs)可以通过识别病原相关分子模式(PAMPs)快速启动先天免疫，对病原体作出应答，是抵抗病原体入侵第一道防线的重要组成部分〔1〕。PAMPs识别病原体的受体目前一致被命名为模式识别受体(PRR)，主要包括Toll 样受体(TLR)、 RIG-1样受体(RLRs)、NLRs和C 型凝集素家族及MDA 5〔2〕。NOD2作为NLRs家族中最具有代表性的成员之一，和自身免疫性疾病的发生有着密切的关系，并参与了先天免疫中的细胞凋亡以及炎症反应，但是NOD蛋白家族与慢性阻塞性肺疾病(COPD)之间的关系尚未见报道。本文旨在探讨NOD2及白细胞介素(IL)-6在COPD发病中的作用。

1 对象和方法

1.1 研究对象 收集川北医学院附属医院呼吸内科2013年10月至2014年4月门诊和住院缓解后的COPD患者的外周血，根据其肺功能〔1 s用力呼气容积(FEV1)/用力肺活量(FVC)%、FEV1占预计值%〕、症状〔英国医学研究委员会(mMRC)呼吸困难指数〕、过去 1 年急性加重次数进行综合评估，患者年龄55～87〔平均(70.76±7.89)〕岁，将患者分为A、B、C、D四组，每组30例。A组是肺功能Ⅰ～Ⅱ级和(或)1年内急性加重次数≤1次及mMRC分级0～1的患者，男14例，女16例，平均年龄(69.23±8.42)岁；B组是肺功能Ⅰ～Ⅱ级和(或)1年内急性加重次数≤1次及mMRC分级≥2的患者，男17例，女13例，平均年龄(71.86±8.23)岁；C组是肺功能Ⅲ～Ⅳ级和(或)1年内急性加重次数≤2次及mMRC分级≥0～1的患者，男15例，女15例，平均年龄(70.57±7.71)岁；D组是肺功能Ⅲ～Ⅳ级和(或)1年内急性加重次数≤2次及mMRC分级≥2的患者，男16例，女14例，平均年龄(71.37±7.27)岁。诊断和分组都符合《慢性阻塞性肺疾病诊断、处理和预防全球策略(2013修订版)》〔3〕，除合并高血压、糖尿病、冠心病、自身免疫系统疾病、癌症、哮喘、结核病等严重疾病，近2 w内未使用茶碱或糖皮质激素。同期门诊健康体检者为对照组，共30例，年龄58～86〔平均(70.23±7.52)〕岁，入选者均无实验室指标异常。各组间性别、年龄无明显差异(P>0.05)。

1.2 主要试剂与仪器 人淋巴细胞分离液(天津灏洋生物公司)，Trizol试剂、实时荧光定量-聚合酶链反应(RT-PCR)试剂盒、荧光染料试剂盒Power SYBR Green PCR Master Mix(TakaRa公司,Japan)，人IL-6定量ELISA试剂盒(Neobiosciense公司，中国)，低温高速离心机5417R(Eppendorf公司，USA)，7900 RT-PCR仪(ABI公司，USA)，肺功能仪3748(HP-Deskjet公司，Germany)，酶标仪model680(Bio-Rad公司，USA)。

1.3 研究方法

1.3.1 设计引物 依据GenBank中人β-actin、NOD2的基因序列设计PCR引物。NOD2上游：5'-CACCCTGACCGTGTCCTGT-3'。下游：5'-CACCTTGCGGGCATTCTT-3'，产物长度159 bp；β-actin上游：5'-GAGCT ACGAGCTGCCTGACG-3'，下游5'-GTAG-TTTCGTGGATGCCACAG-3'，产物长度128 bp。

1.3.2 总RNA提取与cDNA合成 取外周静脉血4 ml，抗凝剂使用EDTA。严格按照说明书操作，分离出外周血单个核细胞，提取总RNA，加30 μl无RNA酶水溶解RNA，最后合成cDNA，-20℃冻存备用。

1.3.3 PCR检测NOD2 mRNA表达 将COPD患者、健康对照者cDNA用荧光定量PCR检测，建立总体积20 μl反应体系。反应条件(40个循环)：95℃ 10 min，95℃ 15 s,60℃ 1 min。每份标本作复孔，复孔间Ct值差异控制在0.5内。目的基因的Ct值减去内参的Ct值作为△Ct，目的基因mRNA表达水平由2-△△Ct表示。

1.3.4 酶联免疫吸附(ELISA)法检测血清IL-6浓度 应用人IL-6定量ELISA试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司，中国)检测各组血清IL-6浓度。

1.4 统计学方法 采用SPSS17.0统计软件进行单因素方差分析、SNK-q法分析及Spearman相关性分析。

2 结 果

2.1 各组外周血单个核细胞NOD2 mRNA、血清IL-6水平比较 见表1。COPD患者外周血单个核细胞NOD2 mRNA及血清IL-6水平均显著高于对照组(P<0.05)。COPD患者D组NOD2 mRNA和IL-6的水平明显高于C组(P<0.05)，C组和D组NOD2 mRNA和IL-6水平均明显高于A组和B组(P<0.05)，A组和B组之间差异无统计学意义(P>0.05)。

表1 各组NOD2 mRNA的表达和血清IL-6水平比较

与对照级比较：1)P<0.05；与A组及B组比较：2)P<0.05；与C组比较：3)P<0.05

2.2 COPD患者NOD2 mRNA表达和血清IL-6含量的相关性 COPD患者外周血单个核细胞核内NOD2 mRNA表达与血清IL-6含量呈正相关(r=0.81，P<0.05)。

3 讨 论

NLR 蛋白家族有其特有的结构特征，所有家族成员都有3个基本结构域，人类基因组命名委员会主要依据其不同的N端功能结构域，把NLRs 家族划分成为五个亚家族：即PYD 、CARD 、BIR 和NLRA 以及NLRX 亚家族〔2〕。体内实验表明，NOD2缺陷的小鼠对细菌感染的易感性会增高，如NOD2缺陷小鼠在接受结核菌感染时，对CD4+,CD8+T细胞的招募能力以及Ⅰ型细胞因子的产生能力会出现下降〔4，5〕。此外，COPD的发病和烟雾的氧化应激具有相关性，有研究表明，氧化应激能够激活核转录因子(NF)-κB，促进炎症介质在肺内的滞留和活化等〔6〕，国外研究证实，NOD2能够激活NF-κB，因此，NOD2在烟雾的氧化应激中的可能参与了NF-κB的激活〔7〕。本研究表明，COPD患者外周血单个核细胞NOD2 mRNA水平明显高于对照组，证实NOD2参与了COPD疾病的发生。

COPD是一种慢性肺部炎症疾病，主要特征是持续存在气流受限〔3〕，预计在2020年将会成为全球范围死亡原因的第3位，导致经济和社会负担增加〔8〕。随着我们对COPD越来越深入的了解，我们从之前单纯对肺功能分级的重视，到现在更加综合的考虑到患者的急性发作次数以及患者的主观症状，并通过对患者资料的综合整理，进行病情评估，更加具有针对性。本研究发现，COPD患者四组之间，D组NOD2 mRNA表达明显高于C组，D组和C组的NOD2 mRNA表达均明显高于A组和B组。而A组和B组之间差异无统计学意义，推测可能是由于A组和B组都属于低风险，肺功能水平及急性发作次数较为接近，对NOD的激活程度较低〔9〕。目前尚无国内外相关数据作为比较，因此，需要更多的研究加以实证。

IL-6是趋化因子家族中的一员,具有多种生物学功能，能增加胶原蛋白凝聚、抑制细胞外基质的分解、刺激成纤维细胞的增殖等，从而导致COPD 气道纤维结缔组织形成和平滑肌增生，在COPD的发生和发展中发挥重要作用〔10〕。本研究结果证实IL-6参与了COPD的发生和发展。国内外研究证明，NOD2通过NF-κB 与MAPK 通路产生多种细胞因子和促炎性因子，包括IL-6 、IL-1β等，同时还能促使机体产生抗菌肽〔11，12〕。本研究显示，COPD患者外周血单个核细胞核内NOD2 mRNA表达同IL-6含量呈正相关。此外，A组和B组之间血清IL-6含量没有明显差异，和在A组和B组中NOD2 mRNA表达的无差异性的结论一致，进一步佐证了两者的相关性。

本研究提示NOD2基因表达升高，在COPD的发生和发展中可能发挥了非常重要的作用，其机制是通过信号的转导，激活血清IL-6等炎症因子的释放，进一步导致COPD患者炎症反应的加重。

1 Kanneganti TD,Lamkanfi M,Nunez G.Intracellular NOD-like receptors in host defense and disease〔J〕.Immunity,2007;27(4):549-59.

2 Shaw MH,Reimer T,Kim YG,etal.NOD-like receptors(NLRs):bona fide intracellular microbial sensors〔J〕.Curr Opin Immunol,2008;20(4):377-82.

3 GOLD Executive Committee.Global strategy for the diagnosis，management，and prevention of chronic obstructive pulmonary disease updated 2013〔EB/OL〕.〔2013-04-01〕.http：//WWW.goldcopd.org/Guidelines/guidelines-resources.html.

4 Divangahi M,Yang T,Kugathasan K,etal.Critical negative regulation of type 1 T cell immunity and immunopathology by signaling adaptor DAP12 during intracellular infection〔J〕.J Immunol,2007;179(6):4015-26.

5 Fulton SA,Martin TD,Redline RW,etal.Pulmonary immune responses during primary mycobacterium bovis-Calmette-Guerin bacillus infection in C57Bl/6 mice〔J〕.Am J Respir Cell Mol Biol,2000;22(3):333-43.

6 Macnee W.Oxidants/antioxidants and COPD〔J〕.Chest,2000;117(5 Suppl 1):303S-317S.

7 Ting JP,Duncan JA,Lei Y.How the noninflammasome NLRs function in the innate immune system〔J〕.Science,2010;327(5963):286-90.

8 Lopez AD,Shibuya K,Rao C,etal.Chronic obstructive pulmonary disease:current burden and future projections〔J〕.Eur Respir J,2006;27(2):397-412.

9 Pauleau AL,Murray PJ.Role of nod2 in the response of macrophages to toll-like receptor agonists〔J〕.Mol Cell Biol,2003;23(21):7531-9.

10 夏 珊，张紫燕.慢性阻塞性肺疾病患者血清IL-6、hs-CRP水平与肺功能指标的关系〔J〕.海南医学院学报，2014；(10)：1349-50,53.

11 洪原城,黄鑫城,范洪涛,等.慢性阻塞性肺疾病合并意识障碍患者血清IFN-γ、IL-1β、NO水平变化的临床意义〔J〕.川北医学院学报,2014;29(6):583-5.

12 Rincon M,Irvin CG.Role of IL-6 in asthma and other inflammatory pulmonary diseases〔J〕.Int J Biol Sci,2012;8(9):1281-90.

〔2016-12-19修回〕

(编辑 曹梦园)

Expression of NOD2 mRNA in peripheral blood monocytes and serum interleukin-6 level in patients with chronic obstructive pulmonary disease

JIA Qin-Yao，CHEN Shao-Ping，LI Xin-Sheng，etal.

Department of Respiratory Medicine，the Affiliated Hospital of North Sichuan Medical College, Nanchong 637000, Sichuan, China

Objective To explore the expression of NOD2 mRNA in peripheral blood monocytes (PBMCs) and serum IL-6 level in the pathogenesis of chronic obstructive pulmonary disease (COPD) and the relationship with the severity of COPD.Methods Comprehensive evaluation of COPD patients in stable phase after outpatient and inpatient treatment，the patients were divided into A, B, C, D groups, 30 cases in each group, 30 healthy examiners in the outpatient on the corresponding period were chosen as healthy control group. PCR method and enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) were respectively adopted to detect the expression of NOD2 mRNA in PBMCs and serum IL-6.Results The expression of NOD2 mRNA and serum IL-6 from the COPD patients were higher than those of healthy control group(P<0.05). The expression of NOD2 mRNA and serum IL-6 of D group were higher than those of C group(P<0.05), the expression of NOD2 mRNA and serum IL-6 of C and D group were both higher than those of A and B group(P<0.05). There were no statistical significant differences in the expression of NOD2 mRNA and serum IL-6 between A and B group(P>0.05). The expression of NOD2 mRNA and serum IL-6 in COPD patients was positively correlated (r=0.81，P<0.05).Conclusions NOD2 mRNA in PBMCs and serum IL-6 participate the progression of airway inflammatory response of COPD and the levels show positive correlation with disease severity.

Chronic obstructive pulmonary disease; NOD2;Interleukin

四川省教育厅科研基金项目(No.13ZA0216)

陈绍平(1964-)，男，教授，硕士生导师，硕士，主要从事呼吸内科临床诊治研究。

贾钦尧(1987-)，男，硕士，医师，主要从事呼吸内科临床诊治研究。

R563.3

A

1005-9202(2017)14-3529-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.14.067