豚鼠局部5-氨基酮戊酸透皮吸收的影响因素

佘文莉 刘 晖 谢 姗 谢光辉 刘宏伟

(暨南大学附属第一医院整形激光美容科，广东 广州 510632)



豚鼠局部5-氨基酮戊酸透皮吸收的影响因素

佘文莉 刘 晖 谢 姗 谢光辉 刘宏伟

(暨南大学附属第一医院整形激光美容科，广东 广州 510632)

目的 观察不同孵育温度、溶剂、pH值、有无角质软化剂等孵育方法对5-氨基酮戊酸(ALA)透皮吸收度的影响。方法 建立豚鼠动物模型，分别采取不同孵育温度、溶剂、pH值、有无角质软化剂等不同条件进行孵育，测定不同孵育方法孵育后病变组织光敏剂的荧光强度。结果 42℃条件下病变组织中光敏剂的荧光强度显著高于在37℃条件下的荧光强度(P<0.05)；以月桂氮卓酮为溶剂的ALA溶液孵育组病变组织中光敏剂的荧光强度均明显高于在生理盐水配置的ALA溶液条件下孵育组(P<0.05)；在pH4.0 ALA溶液条件下孵育组病变组织中光敏剂的荧光强度均明显高于在pH7.0和pH10.0的ALA溶液条件下的孵育组(P<0.05)；使用角质软化剂预敷组的病变组织中光敏剂的荧光强度均明显高于未经过预敷组(P<0.05)。结论 较高的孵育温度、较低的pH值以及透皮促进剂和角质软化剂的加入均有利于提高局部ALA透皮吸收。

5-氨基酮戊酸；透皮吸收

5-氨基酮戊酸(ALA)作为一种新型的光敏剂，用于光动力治疗具有很好的疗效，其介导的光动力治疗创新性应用于良性皮肤病的基础与临床应用研究引人注目〔1，2〕。ALA作为机体合成血红素的前体物质，正常存在于人体细胞中，其本身并不具有光敏性，在细胞中经过一系列酶作用后才生成具有光敏性的原卟啉(Pp)IX〔3～5〕。ALA光动力治疗在靶组织产生的PpIX比在周围正常组织产生的要多，其可能的原因是病变组织含有的亚铁鳌合酶以及可供利用的铁离子比周围正常组织少，病变组织的细胞通透性发生变化，病变组织的pH值较低〔6〕。ALA光动力治疗用于银屑病、尖锐湿疣、多毛症等皮肤疾病的治疗已经取得了一定的疗效，但是ALA皮肤穿透能力差、生物利用度不高一直是限制该项技术进一步发展的关键问题〔3〕。本研究通过观察不同孵育温度、溶剂、pH值、有无角质软化剂等孵育方法对ALA透皮吸收度的影响，分析找出局部ALA外用的最佳孵育方法。

1 材料与方法

1.1 一般资料 半导体激光治疗仪(输出波长 635 nm，输出功率0～200 mW，广州市激光技术应用研究所)；光谱采集设备采用光学多通道分析仪(OMA)，主要包括MS257型光谱仪(美国Oriel公司，波长探测范围590～735 nm，分辨率约为0.37 nm)和具有时间闸门的致冷像增强型光谱探测器ICCD(InstaSpecTM Ⅴ型ICCD，英国Andor公司，像敏面阵像素数为385×578，单次开门时间25 ms，积分20次)，荧光信号经控制卡转换后输入计算机进行后续处理；SS20-2动物恒温毯(上海欣曼科教设备有限公司)。5-ALA粉剂(上海瀚鸿化工科技有限公司，批号BH-5005-091231)为>99%白色粉末状，每包5 g，每次治疗前在避光条件下以无菌生理盐水配制成浓度为20%的溶液，避光储存；戊巴比妥钠(美国Sigma公司，批号P3761)> 99%微黄白色粉末25 g每瓶，配制成浓度为0.2 ml/100 g的溶液；月桂氮卓酮(武汉鑫嘉林生物有限公司，批号20080503)；水杨酸、枸橼酸、磷酸氢二钠和氯化铵(上海南翔试剂有限公司)等；所用试剂均为分析纯。健康成年豚鼠36只，雌雄各半，体质量250～300 g，(许可证号SCXK<粤>20030002 粤监证字A027)由广东省实验动物中心提供。

1.2 方法

1.2.1 豚鼠动物模型建立 将成年豚鼠随机分为A、B、C、D、E、F、G、H、I组，每组又分别作用1、2、3、4 h，每组每个时间点每组4只豚鼠，用龙胆紫溶液在每只豚鼠背部皮损处标记出1 cm×1 cm大小范围为实验区域。5%心得安搽剂(暨南大学第一附属医院药剂科自制，含盐酸普萘洛尔粉50 mg)外涂背部标记皮肤，3次/d，每次约1 ml，连续2 w，建模成功后待用，实验前戊巴比妥钠30 mg/kg麻醉。

1.2.2 不同孵育温度对ALA透皮吸收和转化的影响 选A、B两组实验动物。用生理盐水配置的20%ALA溶剂在避光条件下涂在标记处，用黑色塑料薄膜避光封包。然后将A组动物恒温毯设置为37℃，置于ALA涂抹处分别孵育1、2、3、4 h；B组动物恒温毯设置为42℃，置于ALA涂抹处分别孵育1、2、3、4 h，荧光光谱法检测组织中光敏剂含量。

1.2.3 不同溶剂对ALA透皮吸收和转化的影响 选C、D两组实验动物。用生理盐水制备20%的ALA溶液在避光条件下涂在C组健康无皮损豚鼠模型后背标记处，用塑料薄膜避光封包，分别孵育1、2、3、4 h；用2%月桂氮卓酮制备20%的ALA生理盐水溶液在避光条件下涂在D组健康豚鼠模型后背标记处，用塑料薄膜避光封包，分别孵育1、2、3、4 h，荧光光谱法检测组织中光敏剂含量。成年豚鼠模型给予ALA前先采集标记区域光谱作为本底〔3〕。给予ALA溶液并经过规定的封包孵育时间后，采用635 nm激光照射，功率密度30 mW/cm2，能量密度12 J/cm2，按要求治疗约30 min，治疗结束前进行荧光采集，数据输入电脑，通过Orign软件进行处理，谱线经自体荧光本底校正、系统噪声校正和光谱交叉校正后，取光敏剂特征峰附近一段区域求平均值即为其荧光强度，使用光敏剂荧光强度代表光敏剂含量。

1.2.4 不同pH值制剂对ALA透皮吸收和转化的影响 选E、F和G共3组实验动物。参照2015版药典附录ⅩⅤD分别配制pH值4.0、7.0、10.0的缓冲溶液，制备3种不同pH值的20%ALA溶液，然后分别将3种不同pH值20%的ALA溶液在避光条件下涂在E、F、G组豚鼠模型后背标记处，用塑料薄膜避光封包；分别孵育1、2、3、4 h，荧光光谱法检测组织中光敏剂含量。

1.2.5 有无角质软化剂对ALA透皮吸收和转化的影响 选H和I两组实验动物。I组实验动物用10%水杨酸湿敷实验区30 min，然后在避光条件下涂抹20%的ALA生理盐水溶剂，用塑料薄膜避光封包；分别孵育1、2、3、4 h，荧光光谱法检测组织中光敏剂含量。H组实验动物不使用水杨酸进行预处理，其他操作与I组实验动物相同，分别孵育1、2、3、4 h，荧光光谱法检测组织中光敏剂含量。

1.3 统计学方法 采用SPSS17.0软件进行t检验。

2 结 果

2.1 不同孵育温度对ALA透皮吸收和转化的影响 B组孵育1、2、3、4 h后，皮损组织中光敏剂的荧光强度均高于A组，且2、3、4 h的荧光强度具差异显著(P<0.05)。见表1。

表1 不同孵育温度对ALA透皮吸收和转化的影响荧光强度)

与A组比较：1)P<0.05

2.2 不同溶剂对ALA透皮吸收和转化的影响 D组孵育1、2、3、4 h后，病变组织中光敏剂的荧光强度均明显高于C组(P<0.05)。见表2。

2.3 不同pH值制剂对ALA透皮吸收和转化的影响 E组孵育1、2、3、4 h后，病变组织中光敏剂的荧光强度均明显高于F组和G组(P<0.05)。F组和G组荧光强度无显著差异(P>0.05)。见表3。

2.4 有无角质软化剂对ALA透皮吸收和转化的影响 有无角质软化剂对ALA透皮吸收和转化的影响结果，Ⅰ组孵育1、2、3、4 h后，病变组织中光敏剂的荧光强度均明显高于H组(P<0.05)。见表4。

表2 不同溶剂对ALA透皮吸收和转化的影响荧光强度)

与C组比较：1)P<0.05

表3 不同pH值制剂对ALA透皮吸收和转化的影响荧光强度)

与F组比较：1)P<0.05；与G组比较：2)P<0.05

表4 有无角质软化剂对ALA透皮吸收和转化的影响荧光强度)

与H组比较：1)P<0.05

3 讨 论

本研究结果显示，较高温度有利于ALA透皮吸收和转化，这可能与高温导致皮下血管扩张血流加速，加快了ALA的透皮吸收和转化，增加了其生物利用度。月桂氮卓酮作为一种透皮促进剂，其使用显著增加了ALA的透皮吸收和转化，说明透皮促进剂的加入对促进ALA透皮吸收和提高其生物利用度有明显作用。说明使用不同pH值的ALA溶液进行孵育，对ALA的透皮吸收和转化影响显著。分析原因，小分子以分子形态存在时，其透皮吸收最大，以离子形态存在时，其透皮吸收较差。在pH值为4.0时，ALA以分子形态存在，透皮吸收最大，因此其荧光强度最大；在pH值为7.0和10.0时，部分ALA以离子形态存在，导致透皮吸收减少，透皮速率下降，即在较低pH值时，ALA具有较好的透皮吸收，但考虑皮肤的承受情况，制剂的pH值不宜过低，以4.0为宜。本研究结果角质软化剂水杨酸的加入，降低了角质层的密度，减弱了角质层的屏障作用，有利于ALA的穿透，增加了ALA的透皮吸收和生物利用度。

1 杨 昀，马 炯，王玉华，等.5-氨基酮戊酸磷脂复合物的研究〔J〕.中国药学杂志，2007;42(1)：36-9.

2 肖 虹.ALA光动力诊断与光动力治疗恶性脑肿瘤的疗效及机制研究〔D〕.重庆：第三军医大学，2009.

3 黄祖芳，陈 荣，李永增，等.DHL细胞中5-ALA代谢PpIX的双光子荧光光谱〔J〕.光谱学与光谱分析，2008;28(11)：2636-9.

4 王杭州.5-ALA介导的光动力对体内外C6胶质瘤细胞杀伤作用研究〔D〕.南京：东南大学，2007.

5 陈冠楠，黄祖芳，陈 荣，等.DHL细胞中5-ALA代谢PpⅨ的定位分析〔J〕.光学学报，2009;29(6)：1605-8.

6 谢 姗，李康英，刘宏伟，等.ALA-PDT对健康人及银屑病患者PBMCs生物效应的实验研究〔J〕.应用激光，2011;31(6)：518-23.

〔2017-04-25修回〕

(编辑 滕欣航)

广东省医学科研课题立项(A2011340)；广州市2014年度花都区第一批科技计划项目(HD14CXY001)

佘文莉(1972-)，女，主管护师，主要从事整形美容激光方面研究。

R39

A

1005-9202(2017)14-3409-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.14.012