五味子乙素对阿尔茨海默病小鼠学习记忆能力及神经细胞凋亡的影响

李佳芮 聂文博 张佳悦 董丹阳 李晓华 杨 擎 李 辉 李 娜 许 多

(吉林大学口腔医学院，吉林 长春 130021)



五味子乙素对阿尔茨海默病小鼠学习记忆能力及神经细胞凋亡的影响

李佳芮 聂文博1张佳悦2董丹阳1李晓华3杨 擎 李 辉4李 娜3许 多1

(吉林大学口腔医学院，吉林 长春 130021)

目的 研究五味子乙素(Sch B)对阿尔茨海默病(AD)小鼠学习记忆能力及神经细胞凋亡的影响。方法 50只BalB/C小鼠随机分为空白组、模型组、阳性药对照组、Sch B低浓度组和Sch B高浓度组。应用Morris水迷宫实验检测AD小鼠的学习记忆功能，HE染色观察AD小鼠脑组织病理形态学变化，流式细胞术和TUNEL染色观察小鼠脑组织神经细胞凋亡，Western印迹法及免疫组织化学法检测AD小鼠脑组织相关凋亡蛋白P53、Bax、Cyto C、C-caspase-9、C-caspase-3的表达。结果 与模型组比较，应用Sch B小鼠水迷宫实验路径和潜伏期较短；HE染色显示，与模型组比较，应用Sch B干预后的AD小鼠海马神经细胞排列较为规整，细胞水肿明显减轻；流式细胞术和TUNEL染色结果显示，凋亡细胞比例明显减少；Western印迹法与免疫组织化学实验显示，Sch B干预后AD小鼠脑组织内P53、Bax、Cyto C、C-caspase-9、C-caspase-3蛋白的表达明显降低(P<0.01)。结论 Sch B能明显改善AD小鼠学习记忆能力，其机制可能与抑制神经细胞凋亡有关。

五味子乙素；阿尔茨海默病；凋亡

阿尔茨海默病(AD)是以中枢神经系统退行性病变为主的老年疾病〔1〕，患者主要表现为记忆力减退、认知功能障碍及人格改变〔2〕。据世界卫生组织估计，至2010年全世界共有3 650万例AD患者〔3～5〕，寻找有效药物预防和治疗AD具有重要的意义。五味子乙素(Sch B)是中药五味子中有效成分，具有抗衰老、抗氧化、抗凋亡等作用〔6〕。项目组前期研究发现，Sch B对损伤神经元具有保护作用〔7〕，本实验观察Sch B对AD小鼠学习记忆的影响及作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物和主要试剂 实验所用BalB/C小鼠购买于吉林大学基础医学院实验动物中心。TUNEL染色试剂盒购自普洛麦格生物技术有限公司，AnnexinV-FITC/PI双染试剂盒购自天津三箭生物技术有限公司，兔抗Bax、P53、Cyto C、C-caspase-9、C-caspase-3、β-actin单克隆抗体购自Proteintech，辣根过氧化物酶(HRP)标记的抗兔多克隆抗体购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

1.2 实验动物及分组 50只健康BalB/C小鼠随机分成5组，每组10只：空白组、模型组、阳性药对照组、Sch B低浓度组，Sch B高浓度组。除空白组外，其余4组每天给予腹腔注射(60 mg/kg)D-半乳糖和氢溴酸东莨菪碱(0.5 mg/kg)，空白组给予等容量的生理盐水进行腹腔注射和灌胃。Sch B低浓度组每日灌胃Sch B 0.1 g/kg，Sch B高浓度组每日腹腔注射Sch B 0.5 g/kg。阳性药对照组每日给予盐酸美金刚3 mg/kg灌胃。除空白外其余各组在造模前预先给药2 w，继续治疗30 d后进行水迷宫检测。

1.3 Morris水迷宫实验 Morris水迷宫是具有自动成像及分析系统的水池，包括起点及放在水池中心的平台，水面高于平台1 cm，水中投入奶粉使其成为乳白色。将小鼠头部染色，于起点处将小鼠头朝水池壁放入水中，训练小鼠发现水池中的站台，在120 s内未发现站台的小鼠将其引领至站台，以2 d为训练期训练。第3日开始试验并记录小鼠运动轨迹，运动时间及距离。120 s内未成功发现站台者，记时间为120 s。

1.4 HE形态学染色 水迷宫试验结束后，杀鼠取小鼠脑组织，4%甲醛固定，石蜡包埋，切片后进行HE染色，观察小鼠脑组织形态学改变。

1.5 流式细胞术 小鼠脑组织研磨后离心，磷酸盐缓冲液(PBS)洗两次，加入100 μl染料结合缓冲液重悬后，先后加入10 μl AnnexinV-FITC和5 μl PI染液(50 mg/L)，混匀后室温避光孵育15 min，补加400 μl结合缓冲液，静置5 min后流式细胞术检测凋亡率。

1.6 TUNEL染色 参照TUNEL说明书方法，小鼠脑组织石蜡切片，用无水乙醇清洗一次3 min，PBS浸洗5 min，二氨基联苯胺(DAB)显色，苏木精复染等步骤后封片，以细胞核有棕黄色颗粒者为阳性细胞，在激光共聚焦显微镜下观察结果。

1.7 Western印迹 脑组织提取蛋白后考马斯亮蓝法进行蛋白定量，十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，转移至聚偏二氟乙烯膜(PVDF)膜。转膜后用三羟甲基氨基甲烷缓盐水(TBST)洗膜3次，每次5 min，3%牛血清白蛋白 (BSA)封闭，一抗4℃孵育过夜，二抗室温孵育2 h，显色液中避光显色，用凝胶成像分析系统测定灰度值，进行半定量分析。

1.8 免疫组织化学染色 小鼠脑组织石蜡切片，浸泡于二甲苯溶液中浸润15 min，用无水乙醇放置5 min，脱蜡水化，先后加入一抗、二抗孵育，DAB显色后对组织进行苏木精染色，光学显微镜200倍视野下观察。

1.9 统计学方法 采用SPSS17.0软件进行方差分析及Q检验。

2 结 果

2.1 Sch B对AD小鼠水迷宫实验潜伏时间和路径的影响 水迷宫结果显示，与空白组相比，模型组小鼠运动轨迹更为复杂，潜伏时间较长(P<0.01)，说明AD模型出现了学习记忆障碍；与模型组比较，Sch B组小鼠潜伏时间较短，运行路径明显缩小(P<0.01)，说明Sch B能明显增强AD小鼠寻找目标物体的记忆功能。见图1、表1。

图1 各组小鼠水迷宫路径比较

组别运动时间(s)运动距离(m)空白组61.39±31.11867.44±356.12模型组113.28±10.831)1907.92±509.251)阳性药对照组29.84±20.722)383.59±259.312)SchB低浓度组87.74±39.241556.41±515.19SchB高浓度组30.93±13.262)530.78±226.312)

与空白组比较：1)P<0.01；与模型组比较：2)P<0.01，下表同

2.2 Sch B对AD小鼠脑形态学改变的影响 HE染色结果显示，与空白组细胞凋亡率〔(4.63±1.40)%〕比较，模型组AD小鼠脑内海马细胞排列紊乱，组织排列疏松，神经细胞出现水肿；而与模型组比较，给予Sch B预保护后小鼠脑组织中海马细胞排列相对整齐，细胞水肿现象明显减轻。见图2。

2.3 Sch B对AD小鼠神经细胞凋亡的影响 流式细胞术结果显示，与空白组细胞凋亡率〔(4.63±1.40)%〕相比，模型组正常细胞数量减少，凋亡细胞明显增加〔(37.92±7.23)%，P<0.05〕。与模型组比，给予Sch B预保护后，凋亡神经细胞明显减少(P<0.05)，且Sch B低浓度组与高浓度组有显著差异〔(19.18±3.47)% vs (13.93±3.71)%，P<0.05〕，阳性药对照组细胞凋亡率为(19.43±7.22)%。TUNEL染色检测凋亡结果显示，与空白组相比，模型组中凋亡细胞明显升高，凋亡细胞密度更大。给予Sch B干预后，AD小鼠脑组织凋亡细胞明显减少。见图3。

图2 各组小鼠脑组织形态学的比较(HE，×400)

图3 TUNEL染色比较各组小鼠神经细胞凋亡情况(×400)

2.4 Sch B对AD小鼠脑组织凋亡蛋白表达的影响 见图4、表2。Western印迹结果显示，与空白组相比，模型组P53、Bax、C-caspase-9和C-caspase-3蛋白表达含量明显增加(P<0.01)。给予Sch B后，小鼠脑组织中P53、Bax、C-caspase-9和C-caspase-3凋亡相关蛋白含量明显减少(P<0.01)。免疫组织化学检测结果显示，组织切片中显示神经细胞染色为黄色或棕褐色为阳性细胞。与空白组对比，模型组阳性细胞数相对较多，给予Sch B干预后，阳性细胞数量明显下降。见图5。

1～5：空白组，模型组，阳性药对照组，Sch B低浓度组，Sch B高浓度组图4 Western印迹法检测各组小鼠脑组织相关凋亡蛋白表达水平

表2 Western印迹检测各组小鼠脑组织中凋亡相关蛋白情况

图5 免疫组织化学法检测各组小鼠神经细胞凋亡相关蛋白表达(DAB，×200)

3 讨 论

AD与脑组织氧化损伤所致的细胞凋亡有关，其典型病理变化有脑神经节缠绕，淀粉样斑块形成〔8〕。中药在防治AD疾病具有明显疗效，Sch B是从传统中药五味子的果实中分离出的二苯并环辛二烯衍生物，临床上用于治疗抗氧化、保护神经元等药理作用〔9〕。项目组在前期实验中发现Sch B对损伤的神经元细胞具有保护作用〔7〕，但其保护作用是否通过抑制脑组织神经细胞凋亡尚不清楚。

线粒体凋亡是经典的凋亡途径，主要受促凋亡基因Bax及原癌基因Bcl-2量的调控〔10〕。正常状态下Bax蛋白与Bcl-2蛋白形成的二聚体Bcl-2/Bax镶嵌在线粒体膜上，Bax蛋白允许小分子物质通过线粒体膜，而其拮抗蛋白Bcl-2作用是封闭Bax孔道活性，从而维持平衡〔11～13〕。当细胞内Bax含量增多时，线粒体膜上的Bax蛋白孔道开放增加，可引起Cyto C的释放〔14〕。从线粒体释放出的Cyto C会与凋亡蛋白酶活化因子(A paf-1)相结合形成的复合物，从而激活Caspase-9蛋白，而活化的Caspase-9会使Caspase的下游Caspase-3蛋白活化〔15〕，从而造成细胞凋亡。P53是多种细胞活动的关键调节剂，可以诱导Bax蛋白的表达，最终导致凋亡的发生〔16〕，引起细胞衰老或死亡〔17〕。

综上所述，Sch B通过下调AD小鼠脑组织P53和Bax蛋白的表达，从而降低细胞质中Cyto C含量，继而下调下游蛋白Caspase-9、Caspase-3的表达，抑制AD小鼠神经元线粒体凋亡，保护受损神经元，改善其记忆能力。

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〔2017-04-07修回〕

(编辑 曹梦园)

吉林省自然科学基金项目(No.20160101229JC);吉林省卫生厅项目(No.2014Z024)

李 娜(1978-)，女，副研究员，主要从事中药药理学研究。

李佳芮(1995-)，女，本科在读，主要从事神经康复研究。

R741.05

A

1005-9202(2017)14-3390-05；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.14.005

1 吉林大学护理学院 2 延边大学医学院

3 长春中医药大学研发中心 4 吉林省前卫医院