二氢杨梅素对绒癌JAR细胞MicroRNA373表达的影响*

王 琳，许 倩，刘 镭，李玉红△，朱佳蒙，范兴源

（1.承德医学院肿瘤研究所，河北 承德 067000；2.承德医学院 2012级临床本科）

二氢杨梅素对绒癌JAR细胞MicroRNA373表达的影响*

王 琳1，许 倩1，刘 镭1，李玉红1△，朱佳蒙2，范兴源2

（1.承德医学院肿瘤研究所，河北 承德 067000；2.承德医学院 2012级临床本科）

目的:探讨二氢杨梅素（DMY）对绒癌JAR细胞MicroRNA373表达的影响。方法：对数生长期绒癌JAR细胞随机分组，DMY终浓度分别为0μg/ml、60μg/ml、80μg/ml、100μg/ml作用24h，采用实时荧光定量PCR法检测JAR细胞MicroRNA373 mRNA的表达水平。结果：DMY组JAR细胞MicroRNA373的表达均明显高于空白对照组；并且，随着DMY浓度的增加，JAR细胞MicroRNA373的表达逐渐升高（P＜0.05）。结论：DMY可升高绒癌JAR细胞MicroRNA373的表达，且呈一定的浓度依赖性。

DMY；MicroRNA373；实时荧光定量PCR；绒毛膜上皮癌

绒毛膜上皮癌简称绒癌，是女性常见的高度恶性肿瘤，病人的死亡率较高，严重影响女性的生殖和健康。目前，绒癌化疗效果较好，能显著提高患者的生存率[1]；但化疗药物具有较大的毒副作用，因此寻找低毒高效的治疗药物具有重大意义[2]。

MicroRNA是一种内源性的非编码双链RNA分子，可通过调节靶基因的表达或翻译来调节细胞的增殖、分化及凋亡[3]。MicroRNA373是众多MicroRNA中的一种，在乳腺癌、宫颈癌、肺癌、口腔鳞状细胞癌及粘液性肠癌等多种肿瘤中均发挥着基因调控的作用[4-7]。

二氢杨梅素（DMY）的主要活性成分是黄酮类化合物，具有清除自由基、抗菌、抗肿瘤、护肝、调节血脂血糖、松弛血管平滑肌和抗高血压等多种生物活性[8-9]；尤其在抗肿瘤方面，DMY具有抗增殖、促凋亡、抑制侵袭等作用[10]，但DMY对绒癌作用的研究报道甚少。本研究通过观察DMY作用后绒癌细胞MicroRNA373表达水平的变化，探讨了DMY对绒癌JAR细胞MicroRNA373表达的影响。

1 材料与方法

1.1 主要材料 绒癌JAR细胞，广州吉尼欧生物科技有限公司；细胞培养基（DMEM）、胎牛血清（FBS）、磷酸盐缓冲液（PBS）、胰蛋白酶（EDtA），美国GiBco公司；培养皿、培养板，美国Coring公司；MicroRNA373引物，上海吉玛制药技术有限公司。

DMY，北京恒元启天化工有限公司。DMY母液（320mg/ml）的配置：精称40.82mg DMY冻干粉，125ml二甲基亚砜DMSO（DMSO为GiBco高纯试剂）溶解分装，-20℃避光保存；DMY工作液（1600μg/ml）的配置：取DMY母液5μl，加培养基995μ l现用现配。

1.2 细胞培养和实验分组 绒癌JAR细胞于含15% FBS的DMEM中，37℃、5% CO2培养箱中常规培养。待细胞融合度达80%时，常规消化细胞后种植到6孔培养板中继续培养，按1:6传代种板，待细胞融合度达30%时，加入DMY工作液，DMY终浓度分别为60μg/ml、80μg/ml、100μg/ml，作用24h；同时设置空白对照组，空白对照组细胞不加DMY，含15% FBS的DMEM常规培养。

1.3 实时荧光定量PCR法检测JAR细胞MicroRNA373 mRNA的表达 加入DMY工作液后JAR细胞继续培养24h。trizol裂解细胞，常规提取细胞总RNA，取1μg总RNA为模板，根据Micro RNA的特异性设计合成反转录引物（引物由上海吉玛制药技术有限公司设计并合成，引物序列见表1），按照染料法Hairpin-ithsa-miR-373定量试剂盒说明逆转录合成cDNA，反应条件：25℃孵育30min，42℃孵育30min，85℃孵育5min，然后进行PCR扩增。PCR扩增反应条件：95℃预变性3min，1个循环；95℃变性12s，62℃退火40s，72℃延伸1min，反应40个循环。同时，以U6作为内参照，每组设6个复孔。相对定量结果采用2-△△Ct法分析。2-△△Ct=2-（△Ct实验组-△Ct空白对照组），△Ct实验组=各实验组Ct值的均值-对应内参U6的均值，△Ct空白对照组=空白对照组Ct值的均值-对应内参U6的均值。

表1 引物序列

1.4 统计分析 采用SPSS 19.0统计学软件处理，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD检验，以P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

JAR细胞MicroRNA373表达的变化：DMY三个浓度组JAR细胞MicroRNA373的表达均明显高于空白对照组；并且，随着DMY作用浓度的增加，JAR细胞MicroRNA373的表达逐渐升高（P＜0.05）。见表2：

表2 JAR细胞MicroRNA373表达的变化

3 讨论

肿瘤的发生发展是众多信号通路复杂作用的结果，研究发现MicroRNA能够通过作用于信号通路中相应靶向mRNA，加快其脱腺苷化进程进而加速mRNA的降解，从而调控并参与细胞的凋亡、分化、代谢和增殖。目前，MicroRNA日渐成为肿瘤研究的热点。作为MicroRNA的一员，MicroRNA373可参与调节肿瘤细胞的凋亡、增殖、分化、侵袭等生物进程，且有多项研究显示，MicroRNA373能作为抑癌基因调控肿瘤的发生发展。Wang等[11]采用PCR等方法分别检测正常宫颈组织和宫颈癌组织MicroRNA373 mRNA的表达情况，发现宫颈癌组织中MicroRNA373的表达量较高；在对结肠癌的研究中发现，通过瞬时转染MicroRNA373能够使致癌因子RAB22A的表达降低，从而抑制肿瘤细胞的生长[12]；曲蕴慧等[13]发现，MicroRNA373能通过介导bcl-6抑制乳腺癌细胞的增殖和侵袭能力；武卫华等[14]也发现，在肺癌细胞A549中通过转染的方法过表达MicroRNA373，可使钙粘蛋白E（E-cadherin）的表达水平增高，从而降低体外培养的人肺癌A549细胞的迁移能力。

绒癌是一种起源于滋养细胞的恶性肿瘤，对化疗具有一定的敏感性，但仍有一部分患者由于耐药、高危和副作用等原因治疗效果不理想。如何降低化疗药物的毒性，改善治疗效果成为绒癌治疗中亟待解决的问题。DMY提取于我国特有的植物—藤茶，初期研究发现其具有抗菌、抗氧化、护肝降糖等作用[9]。近年的抗肿瘤研究发现，DMY可通过增强细胞免疫功能、抑制肿瘤血管生长、促凋亡抑增殖、增加化疗敏感性等发挥较强的抗癌作用。DMY可阻滞细胞从G1期向S期进展，使大量肿瘤细胞停滞在G1期，从而抑制肿瘤细胞DNA的合成与翻译，因此，DMY可通过阻滞肿瘤细胞的细胞周期发挥抑制肿瘤细胞增殖的作用；另外，DMY还能通过影响肿瘤细胞的运动和粘附，阻断血管内皮生长因子（VEGF）与其受体相结合，减慢肿瘤血管内皮细胞的生长速度，抑制肿瘤血管生成，从而阻止肿瘤的生长及侵袭转移。本课题组的前期研究亦发现，DMY可促进肺癌A549细胞凋亡[15]。上述研究结果提示，DMY可能成为一种新的抗肿瘤药物应用于临床，但DMY对绒癌的作用目前尚无文献报道。

本研究发现，DMY可升高绒癌JAR细胞MicroRNA373的表达，且随着DMY浓度的增加，JAR细胞MicroRNA373的表达逐渐升高，呈一定的量效关系。本研究提示，DMY可能通过增强抑癌基因MicroRNA373的表达发挥抑制绒癌细胞生长的作用，但此种调控作用是通过抑制肿瘤细胞增殖、调控细胞周期还是通过诱导肿瘤细胞凋亡实现的，尚需进一步的探讨。

[1]陈瑜.妊娠合并部分性葡萄胎或绒癌临床研究分析[J].中外医疗，2011，30（36）：60.

[2]邓晓晶，邓敏，宋育林，等.miRNA-34a对人胃癌SGC-7901细胞增殖凋亡的影响[J].安徽医科大学学报，2015，50（8）：1090-1094.

[3]Hafez MM,Hassan ZΚ,Zekri AR,et al.MicroRNAs and metastasis -related gene expression in Egyptian breast cancer patients[J]. Asian Pac J Cancer Prev,2012,13(2):591-598.

[4]刘文稚.miR-373在食管鳞状细胞癌中的功能及作用机制研究[D].济南：山东大学，2016.

[5]邱钧.miR-200c、miR-373在乳腺癌干细胞中的表达及其靶基因分析[D].重庆：第三军医大学，2011.

[6]Eyking A,Reis H,Frank M,et al.MiR-205 and mir-373 are associated with aggressive human mucinous colorectal cancer[J].PLoS One,2016,11(6):e0156871.

[7]Adi Harel S,Bossel Ben-Moshe N, Aylon Y,et al. Reactivation of epigenetically silenced miR-512 and miR-373 sensitizes lung cancer cells to cisplatin and restricts tumor growth[J].Cell Death Differ,2015,22(8):1328-1340.

[8]Rais J,Jafri A,Siddiqui S,et al.Phytochemicals in the treatment of ovarian cancer[J].Front Biosci(Elite Ed),2017,9:67-75.

[9]董倩倩，陈立峰.二氢杨梅素药理研究进展[J].中南药学，2005，3(5)：295-298.

[10]Tang N,Ma J,Wang ΚS,et al.Dihydromyricetin suppresses TNF-alpha-induced NF-kappaB activation and target gene expression [J].Mol Cell Biochem,2016,422(1-2):11-20.

[11]Wang LQ,Zhang Y,Yan H,et al.MicroRNA-373 functions as an oncogene and targets YOD1 gene in cervical cancer[J]. Biochem Biophys Res Commun,2015,459(3):515-520.

[12]梁敏，史志周，白洁.miR-373与肿瘤相关研究进展[J].生命科学，2013，25(7)：685-689.

[13]曲蕴慧，刘红涛，郑丽娟，等.微小RNA-373对乳腺癌细胞增殖和侵袭能力的影响及其机制[J].中华医学杂志，2017，97（8）：603-607.

[14]武卫华.MicroRNA-373诱导E-钙粘蛋白表达及其对肺癌A549细胞生长的影响[D].重庆：重庆医科大学，2011.

[15]孙大永，左彦珍，梁鸿鹄，等.二氢杨梅素对肺癌A549细胞凋亡的作用[J].解剖学报，2015，46（3）：359-362.

(基础医学栏目编辑：陈志宏)

EFFECTS OF DMY ON MICRORNA373 EXPRESSION IN CHORIOCARCINOMA JAR CELLS

WANG Lin, XU Qian, LIU Lei, et al
(Institute of Oncology, Chengde Medical College, Hebei Chengde 067000, China)

Objective: To investigate the effects of dihydromyricetin (DMY) on MicroRNA373 expression in choriocarcinoma JAR cells. Methods: JAR cells in logarithmic growth phase were treated with different concentrations of DMY (0μg/ml, 60μg/ml, 80μg/ml, 100μg/ml) for 24 hours, then the MicroRNA373 mRNA expression in JAR cells were detected by real time fluorescence quantitative PCR. Results:The MicroRNA373 expression of JAR cells in 3 DMY groups was all obviously higher than blank control group. Moreover, the MicroRNA373 expression gradually increased with increasing of DMY concentration (P＜0.05). Conclusions: DMY can increase the MicroRNA373 expression in choriocarcinoma JAR cells in concentration dependent manner.

Dihydromyricetin (DMY); MicroRNA373; Real time fuorescence quantitative PCR; Choriocarcinoma

R737.33

A

1004-6879（2017）04-0278-03

2016-09-30）

* 河北省高校重点学科建设项目（冀教高【2013】4号），河北省自然基金项目（H2012406010），河北省计生委项目（2013-A13），河北省教育厅项目（QN2016012）

△ 通讯作者