黑龙江地区鲤疱疹病毒3型的流行病学调查及其主要囊膜蛋白的抗原表位预测

李 渊，徐黎明，赵景壮，刘 淼，任广明，尹家胜，纪 锋，卢彤岩

(1.中国水产科学研究院黑龙江水产研究所，哈尔滨 150070；2.上海海洋大学水产与生命学院，上海 201306)

黑龙江地区鲤疱疹病毒3型的流行病学调查及其主要囊膜蛋白的抗原表位预测

李 渊1,2，徐黎明1，赵景壮1，刘 淼1，任广明1，尹家胜1，纪 锋1，卢彤岩1

(1.中国水产科学研究院黑龙江水产研究所，哈尔滨 150070；2.上海海洋大学水产与生命学院，上海 201306)

2015-2016年对来自黑龙江地区46个养殖场送检的鲤鱼进行锦鲤疱疹病毒(Koi herpes virus，KHV)的分离鉴定，并应用DNAStar等软件对检出的阳性样本的主要囊膜蛋白(Major envelop protein，MEP)基因进行生物信息学分析。结果显示，KHV的检出率约为6.5%，3株阳性样本具有相同的MEP基因序列，称之为KHV-HLJ1516。MEP基因开放阅读框为771 bp，编码256个氨基酸，相对分子质量为28 280.58，等电点为8.40。对KHV-HLJ1516的MEP基因序列同源性分析表明，其与KHV-GZ11分离株仅有1个碱基不同，但并未导致氨基酸发生改变，碱基相似性为99%；而与HZ419分离株相比，KHV-HLJ1516的MEP基因有3个碱基发生突变，相应的氨基酸由Asn变为IIe。聚类分析结果显示，KHV-HLJ1516与KHV-GZ11处于同一分支，而HZ419位于另一分支。B细胞抗原表位预测结果显示，KHV-HLJ1516的MEP的抗原表位主要位于4～11，24～40，42～63，82～110，209～218，238～249氨基酸区段。

鲤疱疹病毒3型；进化分析；流行病学；B细胞抗原表位；预测

锦鲤疱疹病毒病(Koi herpes virus disease，KHVD)是由锦鲤疱疹病毒(Koi herpes virus，KHV)引起的锦鲤和鲤鱼的一种高致病性疾病，出现症状后24～48 h死亡，死亡率高达80%～90%[1]。到目前为止，包括亚洲、欧洲和北美洲等多个国家均发现该病毒。所以快速准确的诊断已成为关注的重点，目前的诊断方法有细胞培养分离技术[2,3]、电镜观察[4,5]、PCR[6]、酶联免疫吸附剂试验(ELISA)[7,8]、原位杂交技术[9]及环介导等温扩增技术(LAMP)[10]等。

锦鲤疱疹病毒(KHV)，又称鲤疱疹病毒Ⅲ型(Cyprinid herpesvirus 3，CyHV-Ⅲ)，属于疱疹病毒科，是双链DNA病毒，有囊膜，与同科的鲤鱼疱疹病毒(cyprinid herpesvirus 1，CyHV-1)、叉尾鮰病毒(channelcatfish virus，CCV)之间有免疫交叉反应[11]。主要囊膜蛋白(Major envelop protein，MEP)是锦鲤疱疹病毒囊膜的主要组成部分，其功能与病毒对细胞吸附、穿入、从细胞核膜出芽释放及诱导细胞融合有关，并有诱导产生中和抗体和细胞毒作用[12]。本研究通过对2015～2016年间我国黑龙江地区送检的鲤鱼进行常规的锦鲤疱疹病毒(Koi herpes virus,KHV)病原监测，采用了KHV国标检测方法，得到3株具有相同MEP基因序列的阳性样本，称之为KHV-HLJ1516；通过对KHV-HLJ1516的MEP的基因序列的系统进化树分析，确定其与其他区域KHV之间的遗传进化关系，掌握该分离株的遗传背景，为我国KHVD的防治提供参考；此外本研究应用相关生物信息学软件对MEP序列进行了B细胞抗原表位综合预测，旨在为进一步研究KHV的MEP的功能及其基因背景信息和分子流行病学的研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

取自2015-2016年间我国黑龙江地区送检的鲤鱼，采集肝、脾和头肾为待检样品。采样数量按SC/T7014-2016中的6.1的规定。DNA聚合酶rTaq premix(大连宝生物公司)；DNAzol ® Reagent(Invitrogen,USA)；DNA Marker 及PCR纯化试剂盒为TaKaRa公司产品。引物均由哈尔滨博莱仕合生物公司合成。

1.2 DNA的提取

将100 μL组织悬液放入1 mL的离心管，再加入1 mL DNAzol，颠倒混匀5次，室温下静置5 min，然后10 000g离心10 min；吸取上清，加入0.5 mL无水乙醇，颠倒混匀5～8次，室温下静置1-3 min，然后5 000g离心5 min；吸弃上清，加入0.8～1 mL 75%乙醇漂洗两次，然后离心；吸弃乙醇，干燥10-15 min；加入0.2～0.3 mL无菌水溶解，即为提取的DNA，作为PCR模板。

1.3 KHV的鉴定

以提取的DNA作为PCR模板。用于KHV检测的引物为国标提供，引物序列：P3∶5′-GACACCACATCTGCAAGGAG-3′，P4∶5′-GACACATGTTACAATGGTCGC-3′。50 μL的体系：rTag 25 μL，引物2 μL，模板2 μL，水21 μL。PCR反应扩增特异性片段。反应参数为94 ℃ 30 s，随后是94 ℃ 30 s，63 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，72 ℃ 7 min，共40个循环，最后保持在4 ℃。1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。

1.4 MEP基因扩增、序列分析及系统进化树构建

以GenBank已登录的锦鲤疱疹病毒MEP基因序列，设计合成引物：P1∶5′-ATGGCAGTCACCAAAGC-3′，P2∶5′-TCACCACATCTTGCCG-3′。以提取的DNA作为PCR模板，进行MEP基因的扩增，反应条件为：93 ℃ 2 min；随后是93 ℃ 1 min，52 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，72 ℃ 10 min，35个循环，最后保持在4 ℃。结束后进行1%琼脂糖凝胶电泳分析，对目的条带进行胶回收，然后将回收产物送上海生工生物公司进行测序。利用DNAStar中的EditSeq软件推导MEP基因的氨基酸序列。并用DNAman对MEP基因序列进行比对。将获得的MEP基因序列BLAST进行序列同源性分析并用MEGA5.05软件构建系统进化树。选择的参考序列来自Genbank中的日本株TUMST1(GenBank：AP008984.1)、美国株KHV-U(GenBank：DQ657948.1)和以色列株KHV-I(GenBank：DQ177346.1)，还有国内的KHV-GZ11(GenBank：KJ627438.1[13]及HZ419 GenBank：KP004896.1)。本研究所分离的KHVHLJ-1516的MEP基因序列已提交Genbank，其accession no.为KY010497。

1.5 MEP的二级结构和抗原表位预测

应用DNAStar软件中的Protean模块分析KHV-HLJ1516的MEP的B细胞抗原表位；Chou-Fasman法和Gamier-Robson法预测其二级结构；Karplus-Schulz法预测其柔性区段；Kyte-Doolittle法分析其亲水性；Emini法预测其表面可能性；Jameson-Wolf 法和Kolaskar-Tongaonkar法(http://tools.immuneepitope.org/tools/bcell/iedb_input)分别预测其抗原指数和抗原表位指数。

2 结果与分析

2.1 病鱼剖检

感染KHV后的鱼皮肤上出现苍白的块斑与血泡，体表分泌大量黏液，眼睛凹陷，腹部充血和出血(图1)。

图1 病鲤的症状Fig.1 Symptoms of infected common carp

2.2 KHV的鉴定

对送检的46份鲤鱼采样(肝、脾、头肾)，提取核酸，利用国标提供的引物进行以Sph为目标基因的PCR扩增。凝胶电泳结果显示在预计大小位置出现特异性目的片段(292 bp)(图2)。通过测序对比三株阳性样本Sph基因片段完全相同，且与Genbank收录的鲤KHV的Sph基因具有100%的相似性，说明三个样本均为KHV。本次调研结果显示黑龙江地区2015～2016年间的KHV检出率约为6.5%。

图2 KHV PCR扩增产物的凝胶电泳分析Fig.2 Gel electrophoresis of PCR product of KHV1，2，3阳性样本PCR产物；N，阴性对照； M，DL2000 DNA marker

2.3 KHV-HLJ1516的MEP基因的扩增及序列测定

以检出的阳性样本为模板，P1、P2为引物，进行PCR基因扩增，然后通过琼脂糖凝胶电泳分析，结果显示得到了与目的条带大小一致的特异性条带(图3)。序列分析结果表明MEP基因开放阅读框长为771 bp，编码含有256个氨基酸的主要囊膜蛋白。MEP预测的相对分子质量为28 280.58，等电点为8.40。值得注意的是这三株阳性样本的MEP具有相同的核酸序列。因此，本研究将这三株KHV分离株称之为KHV-HLJ1516。

图3 KHV-HLJ1516主要囊膜蛋白基因PCR 扩增产物的凝胶电泳分析Fig.3 Gel electrophoresis of PCR product of MEP gene of KHV-HLJ15161，2，3阳性样本PCR产物；M，DL2000 DNA marker

2.4 KHV-HLJ1516的MEP基因序列比对及遗传进化分析

将测序结果与GenBank中收录的MEP基因序列进行比较，结果表明，广州某地区的KHV-GZ11、KHV-I、KHV-U和TUMST1分离株的MEP核酸序列相似性均为100%，而KHV-HLJ1516的MEP基因与KHV-GZ11的MEP基因相似性为99%，其MEP基因有1个碱基发生了突变，但并未导致该位点的氨基酸发生改变；而与国内的HZ419分离株相比，KHV-HLJ1516的MEP基因有3个碱基发生了突变，并影响了相应的氨基酸由Asn变成了IIe。系统进化树结果显示，KHV-HLJ1516与KHV-GZ11与KHV-I、KHV-U和TUMST1分离株均处于同一个分支，而国内的HZ419分离株却位于另一分支(图4)。

图4 基于KHV-HLJ1516主要囊膜蛋白基因序列构建的系统进化树Fig.4 Phylogenetic tree based on the MEP gene sequence of KHV-HLJ1516

2.5 KHV-HLJ1516的MEP二级结构和抗原表位分析

应用Garnier-Robson法和Chou-Fasman法预测MEP的二级结构发现，其预测的α-螺旋、β-折叠和β-转角存在较多的重合区域(图5)。预测的二级结构显示：KHV-HLJ1516的MEP是以α-螺旋和β-折叠为主有一定的β-转角和无规则卷曲结构的混合型蛋白，α-螺旋和β-折叠一般是起支架作用，蛋白质的功能部位和酶的活动中心一般在无规则卷曲部位。

图5 不同方法预测的KHV-HLJ1516的主要囊膜蛋白的二级结构Fig.5 Secondary structure of MEP of KHV-HLJ1516 predicted by various methods A: α-螺旋；B: β-折叠；T: β-转角；C: 无规则卷曲。

Karplus-Schulz法预测的MEP柔性区段位置为：5，10～16，22～30，40～41，71～73，108～110，149～152，177～180，192～196，201～205，

218～239，243～253，这些区域有一定的柔韧性，形成抗原表位的可能性较大(图6)。

图6 Karplus-Schulz法预测KHV-HLJ1516的主要囊膜蛋白的柔性区段Fig.6 Flexible regions of MEP of KHV-HLJ1516 predicted by Karplus-Schulz method

Kyke-Doolittle法氨基酸亲水性预测结果显示，KHV-HLJ1516的MEP的亲水性较低，亲水性区段主要在氨基酸序列的后段，提示该区段位于蛋白表面的可能性最大，作为抗原表位的几率也相对较高。Emini法分析MEP的表面可能性结果显示，可能性较大的区域为：7～13，68～75，147～151，198～214，221～237，245～253，因此，这些区段很有可能位于蛋白的表面，可能是B细胞的优势区域(图7)。

图7 KHV-HLJ1516的主要囊膜蛋白的表面可能性分析Fig.7 Surface probability of MEP of KHV-HLJ1516

2.6 KHV-HLJ1516的MEP抗原指数和抗原表位指数

Jameson-Wolf法对MEP的抗原指数进行预测，可看出MEP中存在许多抗原指数较高的区域，其中区段最大的位置在218～239，因此该段有可能是优势抗原表位；还有一些其他抗原指数较高的区段，如7～16，22～31，36～43，69～77，104～111，184～196，198～211，243～255形成抗原表位的可能性也较大(图8)。

图8 KHV-HLJ1516的主要囊膜蛋白的抗原指数分析Fig.8 Antigenic index of MEP of KHV-HLJ1516

Kolaskar-Tongaonkar法[14]预测的MEP抗原表位平均抗原指数为1.051，最大值为1.265，最小值为0.917。

2.8 KHV-HLJ1516的MEP B细胞表位预测结果综合分析

如果某一氨基酸区段中：抗原指数≥1.033，亲水性指数≥0，氨基酸的抗原表位可能性指数≥1，氨基酸个数大于等于7个，并且其内部或附近又含有柔性结构区域，则这一区段有可能是抗原表位。Kolaskar-Tongaonkar方法预测大于7个氨基酸的KHV-HLJ1516的MEP抗原表位分析结果可以直接给出抗原表位的序列，见表1。表位大小至多不超过30个氨基酸残基。综合以上考虑，本研究预测的KHV-HLJ1516的MEP可能的B细胞抗原表位区段主要位于4～11，24～40，42～63，82～110，209～218，238～249氨基酸区段。

表1 KHV-HLJ1516的主要囊膜蛋白的B细胞抗原表位的氨基酸序列Tab 1 Amino acid sequence of B cell antigenic epitope of MEP of KHV-HLJ1516

3 讨论

KHVD自1997年首次报道以来，传播、流行于亚洲、欧洲、北美及非洲多个国家[15]。2002年，刘荭等[16]首次报道KHVD传到中国广东，时隔三年后，周永灿等[17]报道已从中国自然感染鲤鱼中检测到KHV，2010年闫春梅等[18]又从吉林省某网箱养殖场检测出KHV，至此表明，KHVD已在中国成蔓延趋势，应引起重视。中国南北地理、气候、环境等差异显著，所以针对北方的KHVD监测就很重要了。2015-2016年，在KHVD易发的季节，课题组对黑龙江省多家鲤鱼养殖场送来的监测鲤鱼样品进行病原检测，从46家养殖场共检出3个阳性样本，检出率约为6.5%，该结果说明KHV已经存在并且流行于黑龙江省的鲤鱼养殖场。KHV 主要感染鲤和锦鲤，其鱼苗、幼鱼、成鱼阶段均可感染[19]，其他鲤科鱼、锦鲤和鲫的杂交后代、锦鲤和金鱼的杂交后代也对其易感[20]。鱼体感染KNV后，在其脑、眼、脾、鳃、肾、肠和肠内容物都能检测出该病毒[21]。所以认为该病是通过水传播的。接种疫苗可能是一种控制KHVD发生的容易想到的办法，该病的减毒苗已经应用于临床[22]，但目前还没有理想的疫苗来防治KHVD[23]，主要靠加强监测，切断传播途径等措施防控。总之，为更好的防制该病暴发流行，需要进行区域的监测管理[24]，加强全球的合作交流，建立有效的检测方法，研制有效的KHV疫苗，保障我国锦鲤和鲤鱼养殖业的健康发展。

在本研究中分离得到的3株KHV阳性样本的MEP基因序列完全一致。在NCBI中对测序的结果直接BLAST分析，结果显示KHV-HLJ1516的MEP核苷酸与参考病毒株的MEP核苷酸相似性均为99%，而KHV-I(以色列)、KHV-U(美国)、TUMST1(日本)和KHV-GZ11(中国广州)的MEP核酸序列100%相同。该结果说明本研究分离的KHV毒株与我国其他地区分离株具有基因序列差异性，可能为新毒株。跟广州KHV-GZ11分离株相比，黑龙江分离株KHV-HLJ1516的MEP基因有1个碱基发生了突变，但并未导致该位点的氨基酸发生改变。而与国内另一参考毒株HZ419相比，其MEP基因有3个碱基发生了突变，并影响了相应的氨基酸由Asn变成了IIe。系统进化树结果显示，KHV-HLJ1516仍与这四株参考毒株处于同一个分支，说明KHV-HLJ1516与广州KHV-GZ11及KHV-I(以色列)、KHV-U(美国)、TUMST1分离株具有相对较近的亲缘关系，而与中国另一KHV分离株HZ419亲缘关系相对较远。

囊膜蛋白通常与病毒的感染甚至病毒的毒力相关[25]。本实验成功获得了KHV长771 bp的MEP基因，编码256个氨基酸，预测的相对分子质量为28 280.58，等电点为8.40。预测的二级结构显示：KHV-HLJ1516的MEP是以α-螺旋和β-折叠为主有一定的β-转角和无规则卷曲结构的混合型蛋白，α-螺旋和β-折叠一般是起支架作用，蛋白质的功能部位和酶的活动中心一般在无规则卷曲部位。抗原表位即抗原决定簇，决定抗原性的特殊化学基团，有效的分析抗原表位有助于疾病的诊断以及疫苗分子的设计。抗原表位筛选方法主要集中在研究B细胞抗原表位，作为B细胞抗原表位首先应位于或易于移动于蛋白质抗原表面，有利于与抗体结合，这样就倾向于参与构成β转角结构。另外，具有一定柔韧性，亲水性强、表面极性大的氨基酸残基通常参与表位构成[26]。表位大小一般由5～7个氨基酸和单糖残基组成，至多也不超过30个氨基酸残基。综合以上考虑，本研究预测的KHV-HLJ1516的MEP可能的B细胞抗原表位区段主要位于4～11，24～40，42～63，82～110，209～218，238～249氨基酸区段，为进一步探索KHV分子流行病学及表位疫苗的构建研究奠定了理论基础。

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(责任编辑：张潇峮)

Epidemiologic investigation of Koi herpes virus type 3 in Heilongjiang province and prediction of antigenic epitopes of major envelope protein

LI Yuan1,2,XU Li-ming1,ZHAO Jing-zhuang1,LIU Miao1,REN Guang-ming1,YIN Jia-sheng1,JI Feng1， LU Tong-yan1

(1.HeilongjiangRiverFisheryResearchInstitute,ChineseAcademyofFisherySciences,Harbin150070,China;2.CollegeofFisheryandLifeScience,ShanghaiOceanUniversity,Shanghai201306,China)

Carps from 46 fish farms of Heilongjiang province were subjected to isolation of Koi herpes virus (KHV) during 2015～2016.The major envelope protein (MEP) gene of the KHV was subjected to bioinformatics analyses by using the DNAStar and other software.The results showed that the detection rate of KHV in Heilongjiang province during 2015～2016 was about 6.5%.The 3 isolated KHV had the same MEP gene sequence,and which were called KHV-HLJ1516.The open reading frame (ORF) of the MEP was 771 bp,encoding 256 amino acids.The predicted relative molecular mass of the MEP was 28280.58 and isoelectric point was 8.40.The homology analysis showed that compared with KHV-GZ11,the MEP gene of the KHV-HLJ1516 had a single site nucleotide mutation which did not cause the change of amino acid.The MEP of KHV-HLJ1516 was 99% identical to KHV-GZ11 at the nucleotide level.Compared with HZ419,KHV-HLJ1516 had 3 nucleotide mutations which caused a mutation from Asn to IIe.The results of cluster analysis showed that KHV-HLJ1516 was clustered in the same branch with KHV-GZ11,while another isolate of HZ419 was clustered in another branch.B cell epitopes of the MEP showed that the likely B cell epitopes of KHV-HLJ1516 MEP were mainly located at 4～11,24～40,42～63,82～110,209～218,238～249 amino acids.

Cyprinid herpesvirus 3;phylogenetic analysis;epidemiology;B cell antigenic epitope;prediction

2016-10-26；

2017-03-18资助项目：黑龙江省应用技术研究与开发计划项目(GA13B401)

李 渊(1989-)，女，硕士研究生，专业方向为鱼类病害防治。E-mail: 1154662843@qq.com

卢彤岩。E-mail: lutongyan@hotmail.com*

S941

A

1000-6907-(2017)04-0037-07