顶空固相微萃取-气相色谱质谱-嗅闻法测定不同品牌红腐乳挥发性风味物质

刘娜，邓莉，张俊杰

(天津春发生物科技集团有限公司研发中心，天津 300300)

顶空固相微萃取-气相色谱质谱-嗅闻法测定不同品牌红腐乳挥发性风味物质

刘娜，邓莉，张俊杰

(天津春发生物科技集团有限公司研发中心，天津 300300)

采用顶空固相微萃取法，结合气质联用技术、气相色谱-嗅闻-质谱技术对不同品牌大块红腐乳的挥发性风味成分进行了分析及比较。在顶空固相微萃取条件优化的基础上，确定了最佳实验条件：2 g样品置于20 mL顶空瓶中，50 ℃下平衡30 min，萃取时间40 min。通过实验共鉴定出64种挥发性成分，其中酯类19种、萜烯类19种、醇类7种、醛类6种、酮类4种、烯烃类3种、酚类2种、杂环化合物2种、烃类2种。腐乳共有挥发性风味成分23种，其中乙醇、α-水芹烯、乙酸乙酯、丁酸乙酯、辛酸乙酯、2-戊基呋喃和茴香脑为主要挥发性风味物质。

红腐乳；顶空固相微萃取；气相色谱-质谱联用；气相色谱-嗅闻；保留指数；风味物质

腐乳又名豆腐乳，也称酱豆腐，是一种微生物发酵大豆制品[1]，具有品种多样、风味独特、滋味鲜美、营养丰富、价格低廉等特点[2]，广受消费者喜爱。按照色泽可以分为红腐乳、白腐乳、青腐乳等[3]。

腐乳中的挥发性风味成分是衡量腐乳质量和工艺的重要指标，对其进行研究不仅可以指导腐乳生产，而且有助于提高腐乳的风味质量，因此研究腐乳风味物质越来越受到开发人员的关注[4]。

在挥发性成分研究中，20世纪80年代发展起来的气相色谱-质谱联用技术(gas chromatography-mass spectrometry,GC-MS)[5]、气相色谱-嗅闻仪联用技术(gas chromatography-olfactory,GC-O)[6-8]开创了风味物质研究分析的新领域。由于样品成分复杂，通常不能直接进入仪器进行分析，需要通过前处理提取后才能上机分析。前处理的方法很多[9]，包括液液萃取、同时蒸馏萃取、顶空吸附等[10]。其中固相微萃取(solid-phase microextraction, SPME)是20世纪90年代发展起来的一种高效的样品预处理技术[11-14]。该技术集采样、浓缩于一体，无需溶剂，操作简单，灵敏度高，非常适合挥发性成分的快速分析[15-17]。

目前关于红腐乳挥发性香气成分的研究报道较少，且大多使用同时蒸馏萃取和水蒸气蒸馏法提取红腐乳香气成分进行分析，鲜少应用SPME对红腐乳进行提取分析的报道。

本实验以不同品牌大块红腐乳为研究对象，采用顶空固相微萃取(headspace solid-phase microextraction, HS-SPME)提取挥发性风味成分，同时优化了HS-SPME提取方法，利用GC-MS和GC-O，结合保留指数(retention index，RI)[18]，对样品中的挥发性风味成分进行定性、定量及风味成分分析及比较，为腐乳相关产品的生产和开发提供一定的理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料和试剂

王致和大块腐乳(340 g/瓶) 北京二商王致和食品有限公司；老才臣大块腐乳(340 g/瓶) 北京市老才臣食品有限公司；咸亨大块腐乳(340 g/瓶) 绍兴咸亨食品股份有限公司；C6～C20正构烷烃标准品 美国Sigma公司。

1.2 设备

6890-5975型气相色谱-质谱联用分析仪 美国安捷伦科技有限公司；Sniffer 9000闻香仪 Brechbühler AG公司；固相微萃取装置手柄和50/30 μm二乙烯苯-聚乙二醇-聚二甲基硅氧烷(DVB-CAR-PDMS)萃取纤维头 美国Supelco公司；MH-2800E型多用恒温箱 天津奥特赛思仪器有限公司；XS205型电子天平 Mettler Toledo公司。

1.3 实验方法

1.3.1 挥发性风味成分提取

将整瓶腐乳(腐乳块和腐乳汁)放入料理机中打碎成均匀的浆液，称取浆液样品2 g，加入到20 mL配有聚四氟乙烯胶垫的顶空瓶中，置于50 ℃多用恒温箱中平衡30 min后，将提前老化处理过的固相微萃取装置穿过胶垫插入密封瓶中，推出萃取头，顶空萃取40 min，取出萃取头，立即插入GC进样口中，解吸3 min，进样分析。

1.3.2 GC-MS分析条件

GC条件：色谱柱：HP-5MS弹性石英毛细管色谱柱(60 m×0.25 mm×0.25 μm)，进样口温度：250 ℃，载气：高纯(≥99.999%)氦气，载气流速：1.0 mL/min，进样方式为不分流进样，色谱柱升温程序：起始温度40 ℃，保持2.0 min，3 ℃/min升至180 ℃，再以10 ℃/min升至250 ℃，保持100 min。

MS条件：EI源，电子能量70 eV，电子倍增器电压1654 V，离子源温度230 ℃，四级杆温度150 ℃，接口温度260 ℃，选用全扫描模式，质量扫描范围：35～450 amu。

1.3.3 RI测定

采用1.3.2中相同的分析条件，进样C6～C20的正构烷烃，以其保留时间计算样品对应的化合物的RI值。化合物保留指数RI计算公式为：

RI样品=100n+(Rt样品-Rtn)×100/(Rtn+1-Rtn)。

式中：RI样品为样品色谱峰的RI；Rt样品，Rtn，Rtn+1分别为样品色谱峰保留时间、样品色谱峰流出前后正构烷烃色谱峰保留时间；n为样品色谱峰流出前正构烷烃所含碳原子数目。

1.3.4 GC-MS分析挥发性成分

挥发性成分经GC-MS分析，各分离组分鉴定由计算机在Nist05谱库和自建香原料库中检索，与标准质谱图对照，仅报道匹配度大于80的组分，同时结合保留指数，采用色谱峰面积归一化法进行相对定量。

1.3.5 GC-O分析挥发性风味成分

GC-O是将嗅闻仪(使用人的鼻子作为检测器来分析气流中的香味)与分离挥发性物质的气相色谱仪结合的一种技术。

我们在气相色谱柱末端安装分流口，将毛细管柱的出口一分为二，一个接MS检测器进行常规的定性分析，一个接气味检测器,通过人的嗅觉鉴别单个成分的风味特征，由闻香人员在闻香仪出口嗅闻所闻到的香味，进行物质定性鉴定，示意图见图1。

图1 气相色谱-质谱-嗅闻联用示意图

2 结果与讨论

2.1 SPME前处理影响因素考察

以王致和大块腐乳为研究对象，分别考察样品量、平衡时间、萃取温度和萃取时间对分析结果的影响。

2.1.1 样品量对萃取效果的影响

样品量过少，色谱峰的强度低，数量少，一些物质难以检出；样品量过多，萃取纤维容易出现吸附饱和情况，造成色谱峰的分离度低，峰型较差。实验考察了不同样品量时的分析效果。结果表明：样品量在2.0 g可满足分析需求,见图2。

图2 不同样品量对萃取效果的影响

2.1.2 样品平衡时间对萃取效果的影响

对10，20，30，40，50 min平衡时间的考察结果表明：样品平衡20～40 min，样品吸附量逐渐增加，而后延长平衡时间，纤维吸附呈下降趋势，故选30 min适宜，见图3。

图3 不同平衡时间对萃取效果的影响

2.1.3 萃取温度对萃取效果的影响

萃取温度是影响萃取速度和效率的重要因素。温度升高，会有更多的分析物从基质中逸出，有利于萃取；然而，SPME是一个放热过程，当温度高到一定程度后，化合物的萃取量反而减少，从而降低萃取头的吸附分析组分的能力。实验考察了不同萃取温度的萃取效果(见图4)，结果表明萃取温度为50 ℃时效果较好。

图4 不同萃取温度对萃取效果的影响

2.1.4 萃取时间对萃取效果的影响

固相微萃取是被分析物在样品基质和萃取头涂层间的富集平衡的过程，一旦达到平衡，被分析物在两相间的浓度达到恒定。本实验考察了不同萃取时间的萃取效果(见图5)。结果表明：萃取时间为40 min时，吸附进样分析效果最好，表明萃取时间为40 min时样品基质和萃取头涂层间的富集过程达到平衡。因此，选定萃取时间为40 min。

图5 不同萃取时间对萃取效果的影响

由图4和图5可知，HS-SPME的优化条件为：2.0 g样品置于20 mL顶空瓶中，50 ℃平衡30 min后，采样40 min后按照1.3进行分析。

2.2 腐乳挥发性风味成分分析结果

按照优化条件，分别测定3种红腐乳挥发性风味成分的GC-MS总离子流色谱图，见图6～图8。色谱图清除背景后应用NIST05谱库和自建香原料库检索，结合保留指数，同时运用嗅闻仪进行感官鉴定，扣除未鉴定组分和固定相流失组分后，鉴定结果见表1。

图6 王致和牌大块腐乳挥发性成分总离子流图

图7 老才臣牌大块腐乳挥发性成分总离子流图

图8 咸亨牌大块腐乳挥发性成分总离子流图

序号保留时间(min)化合物名称种类峰面积相对百分含量(%)王致和大块腐乳匹配度老才臣大块腐乳匹配度咸亨大块腐乳匹配度RI风味描述鉴定方法18.317乙醇醇类55.439039.319044.5689酒味MS,O29.386异丁醛醛类0.17900.07830.2384632刺激MS,O,R310.481乙酸乙酯酯类4.44914.36905.6586678甜香MS,O,R411.625异戊醛醛类0.35870.27900.7689713果香MS,O,R512.0532-甲基丁醛醛类0.58860.27881.3786725焦香MS,O,R613.1892-乙基呋喃杂环0.2900.1588//758焦香MS,O,R713.3042-甲基-2,4-己二烯烯烃0.288////761MS813.641丙酸乙酯酯类0.5860.14830.6490769菠萝香MS,O,R914.442异戊醇醇类//0.2488//794微苦味MS,O,R1014.6872-甲基-1-丁醇醇类0.36850.39890.5288807清凉味MS,O,R1115.617异丁酸乙酯酯类0.28900.11900.1290818奶油香MS,O,R1217.534丁酸乙酯酯类5.61941.03936.2297852甜果香MS,O,R1320.011异戊酸乙酯酯类0.2582////910酸甜香MS,O,R1420.1682-甲基丁酸乙酯酯类0.55900.1870.289913果香MS,O,R1520.505异丁醛二乙缩醛醛类//0.05840.2282919MS1620.966正己醇醇类0.4588////928木香MS,R1722.1432-庚酮酮类0.52900.18910.3386948果香MS,O,R1822.406苯乙烯烯烃0.44940.07902.2387952有特殊香气MS,O,R1922.612戊酸乙酯酯类0.31880.06860.1688958苹果香MS,O,R2024.735a-蒎烯萜烯//0.1193//992木香MS,O,R2125.4341,1-二乙氧基-3-甲基丁烷烃类////0.18871015MS2225.5331,1-二乙氧基-2-甲基丁烷烃类0.0588//0.25861017MS2326.192苯甲醛醛类0.26910.2901.17911030杏仁香MS,O,R2426.8581-辛烯-3-醇醇类0.77890.38880.75861043花香MS,O,R2526.965苯酚酚类////2.06861046甜香MS,O,R2627.132β-蒎烯萜烯0.09800.0488//1049松脂香MS,O,R2727.273-辛酮酮类0.12870.0588//1052甜香MS,O,R2827.525β-月桂烯萜烯//1.8390//1057酯香MS,O,R2927.5992-戊基呋喃杂环2.18942.94943.54861058焦香MS,O,R3027.846α-水芹烯萜烯6.68944.23909.19911063菠萝香MS,O,R3128.471己酸乙酯酯类//0.1787//1075薄荷香MS,O,R3228.8093-蒈烯萜烯//0.0894//1082木香MS,O3329.1054-蒈烯萜烯//0.1495//1088橘香MS,O3429.763松油烯萜烯1.08962.997//1098MS,R3529.846β-水芹烯萜烯//0.6691//1103柠檬香MS,O,R3629.969D-柠檬烯萜烯3.14990.8493//1105果香MS,O,R3730.537桉叶油醇醇类//0.1895//1117清凉香MS,O,R3830.553罗勒烯萜烯0.0784//0.53901118果香MS,O,R3931.294苯乙醛醛类0.04940.2896//1133清香MS,O,R4032.759γ-萜品烯萜烯0.36900.17900.29861158奶香MS,O,R4132.8662-壬酮酮类//0.1495//1165MS,R

续 表

注：表中鉴定方法列“MS，O，R”分别代表“质谱鉴定、嗅闻鉴定和保留指数鉴定”；“/”为“未检出”。

2.3 3种腐乳风味成分分析

由表1可知，3个品牌大块腐乳中共鉴定出9类共计64种挥发性成分，其中酯类19种、萜烯类19种、醇类7种、醛类6种、酮类4种、烯烃类3种、酚类2种、杂环化合物2种、烃类2种。

王致和大块腐乳共鉴定出挥发性风味成分42种，占挥发性成分总量的93.12%，其中醇类4种(57.01%)、酯类14种(17.84%)、萜烯类10种(12.74%)、杂环类2种(2.38%)、醛类5种(1.4%)、酮类3种(0.83%)、烯烃类3种(0.64%)、酚类1种(0.23%)、烃类1种(0.05%)，其中含量较高组分为乙醇(55.43%)、α-水芹烯(6.68%)、丁酸乙酯(5.61%)、辛酸乙酯(4.61%)、乙酸乙酯(4.44%)、D-柠檬烯(3.14%)、2-戊基呋喃(2.18%)、松油烯(1.08%)。

老才臣大块腐乳共鉴定出挥发性风味成分49种，占挥发性成分总量的95.11%，其中醇类6种(40.86%)、萜烯类18种(35.85%)、酯类11种(11.85%)、杂环类2种(3.09%)、酚类1种(1.85%)、醛类6种(1.14%)、酮类3种(0.37%)、烯烃类1种(0.1%)，其中含量较高组分为乙醇(39.31%)、茴香脑(22.1%)、辛酸乙酯(4.70%)、乙酸乙酯(4.36%)、α-水芹烯(4.23%)、2-戊基呋喃(2.94%)、松油烯(2.9%)、丁香酚(1.85%)、β-月桂烯(1.83%)、丁酸乙酯(1.03%)。

咸亨大块腐乳共鉴定出挥发性风味成分33种，占挥发性成分总量的93.08%，其中醇类4种(46.25%)、酯类13种(23.66%)、萜烯类5种(10.83%)、杂环类1种(3.54%)、醛类5种(3.74%)、烯烃类1种(2.23%)、酚类1种(2.06%)、烃类2种(0.43%)、酮类1种(0.33%)，其中含量较高组分为乙醇(44.56%)、α-水芹烯(9.19%)、丁酸乙酯(6.22%)、乙酸乙酯(5.65%)、辛酸乙酯(5.08%)、2-戊基呋喃(3.54%)、苯乙烯(2.23%)、苯酚(2.06%)、十六酸乙酯(1.67%)、肉豆蔻酸乙酯(1.51%)、2-甲基丁醛(1.37%)、苯甲醛(1.17%)。

图9 腐乳物质种类比较图

图10 不同品牌腐乳主要成分比较图

由图9和图10可知，3种腐乳中醇类物质含量最高(均大于40%)，其中乙醇为主要风味物质，其次为酯类、萜烯类物质，这3类物质分别占各自挥发性成分含量87.59%，88.56%，80.74%，是腐乳的主要风味物质类型，其余杂环物质等6种物质含量较少，因此3种腐乳风味具有一定共性。通过比较发现：王致和大块腐乳中醇类含量高达57.01%，高于其他2种腐乳含量(老才臣40.86%、咸亨46.25%)，酒香最为明显；老才臣大块腐乳中萜烯含量高于另外2种腐乳，其中主要萜烯物质茴香脑的含量远高于其他2种腐乳含量，一定程度上说明老才臣生产中使用的辛香料用量要大于王致和和咸亨的辛香料用量；另外咸亨腐乳酯类物质含量高于其余2种腐乳含量，甜香浓厚，这些区别使得3种腐乳香气各有不同。

2.4 腐乳共有挥发性风味成分分析

3种腐乳共有挥发性成分共计23种，分别为3种醇(乙醇、2-甲基-1-丁醇和1-辛烯-3-醇)，9种酯(乙酸乙酯、丙酸乙酯、异丁酸乙酯、丁酸乙酯、2-甲基丁酸乙酯、戊酸乙酯、庚酸乙酯、辛酸乙酯和十六酸乙酯)，4种萜烯(α-水芹烯、γ-萜品烯、茴香脑和石竹烯)，4种醛(异丁醛、异戊醛、2-甲基丁醛和苯甲醛)，酮、烯烃和杂环化合物各1种(分别为2-庚酮、苯乙烯、2-戊基呋喃)，这7类共有物质分别占王致和、老才臣和咸亨腐乳总挥发性成分的85.42%，82.7%和85.87%，3种腐乳成分中含量最高的均为乙醇。

图11 腐乳共有组分种类比较图

由图11可知，共有组分中，醇类是腐乳香气的主体成分(40%以上)，赋予腐乳醇厚的酒香气息；其次，酯类整体含量也较高，且全部为乙酯，可能与香气中乙醇含量较高或生产过程加入乙醇有关[19]，短链脂肪酸乙酯(乙酸乙酯等)赋予腐乳果香和甜香，长链脂肪酸乙酯(十六酸乙酯)含量较低。

图12 不同品牌腐乳主要共有组分比较图

由图12可知，在腐乳的共有组分中，含量较多的物质分别为乙醇、α-水芹烯、乙酸乙酯、丁酸乙酯、辛酸乙酯、2-戊基呋喃和茴香脑，这些共有成分及种类使得3种红腐乳具有相似的香气特征，是腐乳主要风味物质。

3 结论

本文应用HS-SPME法结合GC-MS和GC-O建立了腐乳风味成分的分析方法。并对影响HS-SPME的实验条件进行了优化，确定了最佳实验条件：2 g样品置于20 mL顶空瓶中，50 ℃下平衡30 min，萃取时间40 min。采用该方法结合保留指数定性、面积归一化方法进行定量分析。

3种红腐乳共鉴定出9类共计64种挥发性成分，其中酯类19种、萜烯类19种、醇类7种、醛类6种、酮类4种、烯烃类3种、酚类2种、含氧化合物2种、烃类2种，鉴定物质分别占王致和、老才臣和咸亨腐乳总挥发性成分的93.12%，95.11%和93.08%；腐乳共有挥发性风味成分23种，其中醇类3种、酯类9种、萜烯类4种、酮、烯烃和杂环化合物各1种，共有物质分别占王致和、老才臣和咸亨腐乳总挥发性成分的85.42%，82.7%和85.87%；乙醇、α-水芹烯、乙酸乙酯、丁酸乙酯、辛酸乙酯、2-戊基呋喃和茴香脑为主要挥发性风味物质。

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Analysis of Volatile Flavor Compounds in Red Preserved Bean Curd with Different Brands by Headspace Solid-phase Micro-extraction and Gas Chromatography-Olfactometry-Mass Spectrometry

LIU Na, DENG Li, ZHANG Jun-jie

(R & D Center of Tianjin Chunfa Biotechnology Group Co.,Ltd.,Tianjin 300300,China)

The headspace solid-phase microextraction(HS-SPME)is combined with gas chromatography and mass spectrometry(GC-MS)and gas chromatography-olfactory-mass spectrometry (GC-O-MS)to determine the volatile flavor compounds in red preserved bean curd with different brands. The optimal extraction conditions are achieved as follows:2.0 g sample is placed in a 20 mL vial; temperature is 50 ℃;equilibrium time is 30 min;extraction time is 40 min. Sixty-four compounds are identified, including 19 esters,19 terpenes,7 alcohols,6 aldehydes,4 ketones,3 alkenes,2 phenols,2 heterocyclics,2 alkanes. There are 23 compounds which are common constituents in 3 kinds of red preserved bean curd. The primary flavor compounds are ethyl alcohol, alpha-phellandrene, ethyl acetate, ethyl butyrate,ethyl octanoate,2-pentylfuran and 1-methoxyl-4(1-propeny1) benzene.

red preserved bean curd；headspace solid-phase microextraction(HS-SPME)；gas chromatography-mass spectrometry(GC-MS)；gas chromatography-olfactory(GC-O)；retention index；flavor compounds

2017-01-28

刘娜(1981-)，女，高级工程师，硕士，研究方向：风味物质中呈香呈味物质分离、分析。

TS214.2

A

10.3969/j.issn.1000-9973.2017.07.032

1000-9973(2017)07-0146-06