双菌株混合发酵生产桑葚果醋工艺的研究

汪晓琳

(江苏食品药品职业技术学院，江苏 淮安 223003)

双菌株混合发酵生产桑葚果醋工艺的研究

汪晓琳

(江苏食品药品职业技术学院，江苏 淮安 223003)

以桑葚为原料，对其果醋生产工艺中的酒精发酵、醋酸发酵进行研究，通过单因素和正交设计试验，确定了果醋生产过程中酒精发酵阶段最佳工艺条件为：初始糖度15%，果汁pH 4.5，酵母接种量10%，发酵温度30 ℃，此时酒精度达到6.03%；醋酸发酵最佳工艺条件为：初始酒精度9%，AS1.41醋酸菌接种量10%，沪酿1.01醋酸菌接种量9%，发酵温度32 ℃，在此工艺条件下，桑葚果醋产酸量最终达到5.95 g/dL，果醋香气浓郁，醋味纯正，是众多果醋产品中的佳品。

桑葚果醋；多菌种；酒精发酵；醋酸发酵

桑葚(Fructusmori)是桑树成熟的果实，因酸甜适口、肉厚汁多而深受广大消费者的喜爱。我国是桑葚种植大国，经统计，除青藏高原外，全国各地均有栽培，桑葚品种、产量均居世界首位[1,2]。随着现代农业的快速发展，桑葚的产量也逐年增加，由于桑葚上市周期短，且贮运保鲜技术尚不成熟，导致果实积压严重。目前，采摘的桑葚鲜果除少量鲜食外，剩余部分可加工成果汁、果酒、果酱，以提高产品的利用率和附加值。以桑果为原料经发酵工艺酿造的果醋不仅具有桑葚特有的果香口感，而且还具有普通食醋的保健价值，现已成为桑葚开发利用的新兴食品[3,4]。

目前有关桑葚果醋发酵工艺的研究报道，大部分均采用单一的酵母菌和醋酸菌为菌种进行酿造，如吴婧婧等[5]在经安琪酵母发酵好的果酒中接入AS1.41恶臭醋酸杆菌，成功酿造了酸度为5.95 g/L的桑葚果醋。针对桑葚果醋采用双菌株混合发酵尤其是在醋酸发酵阶段应用两种菌株进行发酵的报道尚不多见。本研究在桑葚果醋醋酸发酵阶段采用两种不同醋酸菌进行混合发酵，通过两种菌在发酵过程中的协同作用，不仅提高果醋中醋酸含量，而且使果醋口感更纯正，提高了桑葚果实利用率，生产过程中的醋渣又可作为畜禽饲料再度利用，具有很好的发展前景。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

桑葚：市售。

活性干酵母：湖北安琪酵母股份有限公司；醋酸菌AS1.41及沪酿1.01：本实验室保藏。

白砂糖：市售一级；琼脂、葡萄糖、CaCO3、酵母膏：国药集团化学试剂有限公司；氢氧化钠：无锡展望化工试剂有限公司。

醋酸菌保藏培养基：酵母膏1%，葡萄糖1%，琼脂1.5%，121 ℃灭菌20 min，冷却至室温后加入2%的CaCO3和3%的酒精。

醋酸菌种子培养基：酵母膏1%，葡萄糖1%，121 ℃灭菌20 min，使用前加入3%的酒精。

醋酸菌扩培培养基：经酒精发酵并过滤处理后所得的桑葚果酒。

1.2 仪器与设备

JYZ-D55型水果榨汁机 九阳股份有限公司；ZHW-200B型恒温震荡培养箱 上海智诚分析仪器制造有限公司；YM75Z型高压蒸汽灭菌锅 上海三申医疗器械有限公司；SW-CF-IF型超净工作台 上海博讯实业有限公司医疗设备厂；DYY-2B酒精计 金坛市恒丰仪器厂；ME204E型电子天平 梅特勒-托利多仪器有限公司；WYT-I 型手持糖量计 成都泰华光学有限公司。

1.3 方法

1.3.1 桑葚果醋制作工艺流程

桑葚→清洗→榨汁→过滤→调pH→调节糖度→灭菌→酒精发酵→过滤→醋酸发酵→澄清→过滤→调配→精滤→灭菌→灌装→二次灭菌→冷却→桑葚果醋。

1.3.2 操作要点

原料处理：挑选个大饱满的桑葚果实，洗净并去除果蒂，用水果榨汁机进行打浆处理，并用洁净的纱布对果浆进行过滤，制得桑葚果汁。

酵母活化：称取一定量的干酵母，加入酵母量30倍的纯化水，搅拌均匀，于35 ℃下活化30～60 min即可使用。

醋酸菌活化：将两种醋酸菌分别按10%的接种量转接到灭菌好的种子培养基中，于30 ℃的恒温震荡培养箱中培养5天，备用。

酒精发酵：桑葚果汁经过过滤后，取100 mL装入到500 mL的三角烧瓶中，接入已活化好的酵母菌，研究酵母菌接种量(5%，10%，15%，20%，25%)、果汁pH(3.5，4.0，4.5，5.0，5.5)、果汁糖度(8%，10%，12%，14%，16%)、发酵温度(26，28，30，32，34 ℃)在酒精发酵过程中对桑葚果酒酒精度的影响。根据单因素试验所得的结果，每个因素选取3个水平采用正交试验对酒精发酵工艺进行进一步的优化。

醋酸发酵：将桑葚果酒过滤除去酵母后按20%的装液量转接到摇瓶中，分别接入已活化好的AS1.41醋酸菌和沪酿1.01醋酸菌进行醋酸发酵，研究AS1.41醋酸菌接种量(4%，6%，8%，10%，12%，14%)、沪酿1.01醋酸菌(4%，6%，8%，10%，12%，14%)、酒精度(2%，4%，6%，8%，10%)、发酵温度(26，28，30，32，34 ℃)对最终所得桑葚果醋的产酸量的影响。根据单因素试验所得的结果，每个因素选取3个水平采用正交试验对果醋醋酸发酵工艺进行进一步的优化。

1.3.3 分析方法

糖度测定：采用手持糖度计测定。

pH值测定：采用酸度计法测定。

酒精度测定：采用酒精比重计法，经过酒精发酵后得到的桑葚果酒进行蒸馏以除去不挥发性成分，将酒精计洗净擦干，缓缓放入到蒸馏出的酒精水溶液中，待其静止后进行读数，同时采用温度计对其温度进行测定，通过查表，换算出溶液的酒精度[6-8]。

酸度测定：采用酸碱中和滴定法，取10 mL的桑葚果醋，定容至100 mL后，移取20 mL至锥形瓶中，用氢氧化钠标准滴定液进行滴定，以酚酞溶液为指示剂，当溶液变为浅粉红色时为滴定终点[9-11]。果醋酸度(以醋酸计)计算公式如下：

式中：X为果醋醋酸含量(g/dL)；C为NaOH标准滴定液的浓度(mol/L)；△V为滴定过程中消耗的NaOH体积(mL)；20.00为锥形瓶中果醋稀释液体积(mL)；60为果醋中醋酸的摩尔质量(g/mol)。

2 结果与分析

2.1 桑葚果醋酒精发酵试验

2.1.1 酵母接种量对果酒中酒精度的影响

桑椹果浆经过过滤后加入白砂糖调节糖度至10%，pH控制在4.0，分别接入5%，10%，15%，20%，25%已活化好的酵母液，在30 ℃下500 mL的三角烧瓶中培养4天后取出并对其酒精度进行测定，结果见表1。

表1 酵母接种量对果酒中酒精度的影响Table 1 Effect of yeast inoculation amount on alcohol content of mulberry wine %

由表1可知，随着酵母接种量的提高，桑葚果酒中的酒精度也逐渐上升，当酵母接种量达到10%时果酒中酒精度达到最高，为5.41%，继续增大酵母接种量，其果酒中酒精度出现下降，由于桑葚果汁中营养物质是有限的，当酵母接种量增大时，有限的营养被大量消耗在酵母生长过程中，导致在产物积累时因营养不够而出现酒精度下降。因此，酵母接种量以10%为宜。

2.1.2 发酵温度对果酒中酒精度的影响

在酒精发酵过程中，调节桑椹果浆糖度至10%，pH控制在4.0，接入10%已活化好的酵母液，设置发酵摇床的温度分别为26，28，30，32，34 ℃，培养4天后测定桑葚果酒的酒精度，结果见表2。

表2 发酵温度对果酒中酒精度的影响Table 2 Effect of fermentation temperature on alcohol content of mulberry wine

由表2可知，当发酵温度为30 ℃时，桑葚果酒酒精含量最高，酒精度达到5.46%，温度过低或者过高都会阻碍酵母菌的生长，导致果酒中酒精含量偏低，因此在桑葚果醋酒精发酵过程中选择发酵温度为30 ℃较为合适。

2.1.3 糖度对果酒中酒精度的影响

桑椹果浆过滤后，采用白砂糖调节桑椹果浆糖度分别为8%,10%,12%,14%,16%，并控制果浆pH至4.0，接入10%已活化好的酵母液，设置发酵摇床的温度为30 ℃，培养4天，采用酒精比重计测定果酒的酒精度，结果见表3。

表3 糖度对果酒中酒精度的影响Table 3 Effect of sugar content on alcohol content of mulberry wine %

由表3可知，桑葚果酒中的酒精度随着糖度的增加呈先上升后下降的趋势，在果汁糖度为14%时发酵所得的果酒酒精度最高，达到5.71%，糖度过低，酵母生长所需营养不够，产物得不到有效积累；糖度过高，酵母生长受到抑制，菌体稀少，无法分泌足够的有效产物，因此本试验选择果汁糖度14%为宜。

2.1.4 果汁pH值对果酒中酒精度的影响

桑椹果浆过滤后，调节桑椹果浆糖度为14%，并控制果浆pH分别为3.5，4.0，4.5，5.0，5.5，按10%的接种量接入已活化好的酵母液，设置发酵摇床的温度为30 ℃，培养4天，对所得的果酒酒精度进行测定，结果见表4。

表4 pH对果酒中酒精度的影响Table 4 Effect of pH on alcohol content of mulberry wine

由表4可知，随着果汁pH值的逐渐升高，桑葚果酒中的酒精度也逐渐增高，当果汁pH达到4.5时，果酒中酒精度达到最大，为5.93%，继续升高果汁pH，果酒酒精度出现下降，这可能是因为溶液过碱时阻碍了酵母的生长，导致发酵过程中酒精得不到有效积累，因此本试验选择果汁pH 4.5为宜。

2.1.5 酒精发酵正交试验设计

为了进一步确定酒精发酵的最佳条件，根据以上单因素试验所得的结果，选取酵母菌接种量、发酵温度、糖度和果汁pH值4个因素，进行了四因素三水平的正交试验，试验设计及结果见表5和表6。

表5 酒精发酵试验因素水平表Table 5 Factors and levels of orthogonal test for alcohol fermentation

表6 酒精发酵的正交试验结果Table 6 Results of orthogonal test for alcohol fermentation

由表6可知，影响酒精发酵工艺因素主次为A>C>B>D，即接种量对果酒中酒精度的影响最大，其次是糖度，发酵温度次之，pH对酒精发酵工艺的影响最小。由表6结果还可以分析出，A因素中A2水平即接种量为10%， B因素中B2水平即发酵温度控制在30 ℃，C因素中C3水平即糖度为15%，D因素中D2水平即pH控制在4.5时，所得的酒精度最高，因此本次酒精发酵过程中最佳工艺组合条件为A2B2C3D2。

在正交试验直观分析的基础上进一步对各数据进行方差分析，结果见表7。

表7 酒精发酵正交试验方差分析Table 7 Analysis of variance of alcoholic fermentation orthogonal experiment

通过比较各因素的F比和F临界值可以看出，A，B，C因素具有显著性，即接种量、糖度及发酵温度对酒精发酵工艺的影响较大，这与表6结果基本一致。

2.2 醋酸发酵试验

2.2.1 菌种选择对果醋中产酸量的影响

在桑葚果酒醋酸发酵菌种选择过程中，我们进行了单、双菌醋酸发酵预试验，具体试验方案如下：将除去酵母后的桑葚果酒过滤，按20%的装液量转接到摇瓶中，调整酒精度至8%，按10%接种量分别接入AS1.41醋酸单菌、沪酿1.01醋酸单菌及混合菌(10% AS1.41醋酸菌+10% 沪酿1.01醋酸菌)进行醋酸发酵，控制发酵温度为30 ℃，经过发酵得到的桑葚果醋中的产酸量见表8。

表8 单菌发酵与混合菌发酵对果醋中产酸量的影响Table 8 Effect of single strain and mixed strains fermentation on acidity of fruit vinegar g/dL

由表8可知，桑葚果醋醋酸发酵过程中，将沪酿1.01醋酸菌和AS1.41醋酸菌混合发酵后果醋中产酸量最大，AS1.41醋酸单菌发酵产酸量次之，沪酿1.01醋酸单菌发酵产酸量最低。AS1.41醋酸菌耐受酒精浓度为8%，最高产醋酸量为7%～9%，沪酿1.01醋酸菌是一个产酸稳定的优良菌种，氧化酒精速度快、能力强，耐酒精度达12%， 但是产酸一般为5%左右，混合发酵可以使两菌产生协同作用，提高产酸量。

2.2.2 醋酸菌接种量对果醋中产酸量的影响

桑葚果酒酒精度调至8%，发酵温度控制在30 ℃，研究沪酿1.01醋酸菌的接种量为10%，AS1.41醋酸菌接种量分别为4%，6%，8%，10%，12%，14%对桑葚果醋中产酸量的影响，然后在其他条件相同的情况下，固定AS1.41醋酸菌接种量为10%，考察沪酿1.01醋酸菌的接种量为4%，6%，8%，10%，12%，14%，醋酸菌接种量对果醋中产酸量的影响，具体结果见图1。

图1 醋酸菌接种量对果醋中产酸量的影响

由图1可知，随着两种醋酸菌接种量的增加，醋酸发酵结束后果醋中的产酸量均呈先增加后降低的趋势，其中AS1.41醋酸菌高效产酸接种量为10%，沪酿1.01醋酸菌高效产酸接种量为8%，说明AS1.41醋酸菌适合较高接种量的发酵，沪酿1.01醋酸菌在低接种量时更具有高效性。

2.2.3 初始酒精度对果醋中产酸量的影响

将桑葚果酒酒精度分别调至2%，4%，6%，8%，10%，接入10%的AS1.41醋酸菌和8%的沪酿1.01醋酸菌，发酵温度控制在30 ℃，进行桑葚果醋醋酸发酵，桑葚果酒初始酒精度对果醋中产酸量的影响结果见图2。

图2 初始酒精度对果醋中产酸量的影响

由图2可知，随着初始酒精度的升高，果醋中产酸量也逐渐增加，当初始酒精度达到8%后继续增加酒精度，最终得到的果酒产酸量降低，这可能是过高浓度的酒精抑制了醋酸菌的生长，使最终果醋的产酸量下降。本试验确定在醋酸发酵前将果酒初始酒精度调至8%为宜。

2.2.4 发酵温度对果醋中产酸量的影响

桑葚果酒酒精度调至8%，接入10%的AS1.41醋酸菌和8%的沪酿1.01醋酸菌，发酵温度分别控制在26，28，30，32，34 ℃，进行桑葚果醋醋酸发酵，考察发酵温度对果醋中产酸量的影响，结果见图3。

图3 发酵温度对果醋中产酸量的影响

由图3可知，随着发酵温度的升高，桑葚果醋中产酸量呈先增加后降低的趋势，在温度32 ℃时达到最大，温度过低过高都将影响醋酸菌的正常生长，导致菌体不能很好地分泌代谢产物，因此本试验选择发酵温度32 ℃较为适宜。

2.2.5 醋酸发酵正交试验设计

为了进一步确定醋酸发酵的最佳条件，在单因素试验结果的基础上，选取AS1.41醋酸菌接种量、沪酿1.01醋酸菌接种量、初始酒精度、发酵温度4个因素，进行了四因素三水平的正交试验，试验设计及结果见表9和表10。

表9 桑葚果醋醋酸发酵试验因素水平表Table 9 Factors and levels of orthogonal experiment for mulberry fruit vinegar acetic acid fermentation

由表9可知，A因素中A2水平即沪酿1.01醋酸菌接种量为10%， B因素中B3水平即AS1.41醋酸菌接种量为9%，C因素中C3水平即初始酒精度为9%，D因素中D2水平即发酵温度控制在32 ℃时，所得的醋酸量相较其他水平高，因此本试验最佳醋酸工艺组合为A2B3C3D2。

表10 桑葚果醋醋酸发酵工艺参数正交试验结果Table 10 Results of orthogonal experiment for mulberry fruit vinegar acetic acid fermentation technological parameters

由表10可知，影响酒精发酵工艺因素的主次为B>A>C=D，即沪酿1.01醋酸菌接种量对果醋产酸量的影响最大，其次是AS1.41醋酸菌接种量，初始酒精度和发酵温度对醋酸发酵工艺影响最小。

在正交试验直观分析的基础上进一步对各数据进行方差分析，结果见表11。

表11 桑葚果醋醋酸发酵正交试验方差分析Table 11 Analysis of variance of orthogonal experiment for mulberry fruit vinegar acetic acid fermentation

通过比较各因素的F比和F临界值可以看出A，B因素的显著性最高，即沪酿1.01醋酸菌接种量和AS1.41醋酸菌接种量对醋酸发酵工艺的影响较大，这与表10结果基本一致。

2.3 产品指标

从感官品质、理化指标[12]及微生物指标[13-15]3个方面对发酵好的果醋进行测评，具体结果如下。

2.3.1 感官品质

色泽：色泽鲜亮，光泽度好；香气：果香浓郁，醋香纯正；风味：酸味柔和，无其他异味；体态：醋体澄清，无其他沉淀。

2.3.2 理化指标

果醋总酸含量(以醋酸计)为5.95 g/dL，可溶性固形物含量为5.27 g/dL，铅含量为0.21 mg/L，砷含量为0.14 mg/L，pH为3.2。

2.3.3 微生物指标

细菌总数为32 cfu/mL，大肠菌群为1 MPN/100 mL，未检出致病菌。

该工艺下生产出的果醋感官品质良好，理化指标及微生物指标均符合GB/T 18187-2000，GB/T 2719-2003等标准。

3 结论

桑葚果醋酿造过程中，酒精发酵的最佳工艺参数为：酵母接种量10%，糖度15%，桑葚果汁pH值4.5，发酵温度30 ℃，在该组合条件下桑葚果酒中酒精度达到6.03%。果醋醋酸发酵的最佳工艺参数为：初始酒精度9%，AS1.41醋酸菌接种量10%，沪酿1.01醋酸菌接种量9%，发酵温度32 ℃，在该组合条件下桑葚果醋中的产酸量最终达到5.95 g/dL，果醋感官品质较好，理化指标及微生物指标检测均符合相关国标的要求。

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[13]GB/T 2719-2003，食醋卫生标准[S].

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Research on Technology of Mulberry Fruit Vinegar Fermented with Double Strains

WANG Xiao-lin

(Jiangsu Food & Pharmaceutical Science College,Huai'an 223003,China)

Use mulberry as raw material, the alcohol fermentation and acetic acid fermentation are studied in the production process of mulberry fruit vinegar, the optimum technological conditions are determined in the production process of fruit vinegar by single-factor and orthogonal test, in the alcohol fermentation stage: the initial sugar content is 15%, fruit juice pH is 4.5, the yeast inoculum dosage is 10%, the fermentation temperature is 30 ℃, the alcohol content reaches 6.03% under these conditions; in the acetic acid fermentation stage:the initial alcohol content is 9%, AS1.41 acetic acid bacteria inoculation amount is 10%, Huniang 1.01 acetic acid bacteria inoculation amount is 9%, the fermentation temperature is 32 ℃, the mulberry fruit vinegar acidity eventually reaches 5.95 g/dL, the fruit vinegar has strong aroma and pure taste, and it is the best product among many kinds of fruit vinegar products.

mulberry vinegar; multi-strains; alcohol fermentation; acetic acid fermentation

2017-01-17

汪晓琳(1979-)，女，讲师，硕士，研究方向：食品加工。

TS201.5

A

10.3969/j.issn.1000-9973.2017.07.021

1000-9973(2017)07-0100-06