液-质联用法对人血浆中吗啡类、氯胺酮和苯丙胺类9种毒品的定性定量检测

王伟乔湜张文芳覃仕扬李清艳

1中国民用航空局民用航空医学中心（民航总医院）（北京 100123）2北京市公安局刑侦总队（北京 100085）

液-质联用法对人血浆中吗啡类、氯胺酮和苯丙胺类9种毒品的定性定量检测

王伟1乔湜1张文芳2覃仕扬2李清艳1

1中国民用航空局民用航空医学中心（民航总医院）（北京 100123）2北京市公安局刑侦总队（北京 100085）

目的：建立同时测定人血浆中吗啡、6-单乙酰吗啡、可待因、海洛因、氯胺酮、3，4-甲二氧基苯异丙胺、3，4-亚甲二氧基甲基安非他明、苯丙胺、甲基苯丙胺的定性定量检测方法。方法：血浆经10%三氯乙酸直接沉淀后进样分析。色谱柱为ACQUITY UPLC HSS C18柱，流动相为含0.01%甲酸的水溶液-0.01%甲酸的甲醇溶液，流速为0.3 mL·min-1，电喷雾离子源，用多反应监测，正离子分段扫描分析。结果：可用保留时间、特征碎片离子、分子离子峰丰度比为指标来定性鉴别血浆中9种化合物。另外，吗啡、可待因、海洛因、氯胺酮、6-单乙酰吗啡、3，4-甲二氧基苯异丙胺、3，4-亚甲二氧基甲基安非他明、苯丙胺、甲基苯丙胺血药浓度分别在5.00×10-3～5.00（r=0.9934），1.00×10-2～10.00（r=0.9905），1.00×10-2～10.00（r=0.9929），2.50×10-3～2.50（r=0.9960），5.00×10-3～5.00（r=0.9925），5.00×10-4～5.00（r=0.9910），5.00×10-4～5.00（r=0.9924），5.00×10-4～5.00（r=0.9920），5.00×10-4～5.00（r=0.9900）μg·mL-1内，线性关系均良好；最低检测限分别为1.00、1.00、1.00、0.50、0.50、0.10、0.10、0.10、0.10 ng·mL-1。日内、日间精密度（RSD）均<18%；提取回收率均>60%，RSD均<15%。结论：该方法灵敏、快速、准确、专属性强，可用于吗啡类、氯胺酮和苯丙胺类9种毒品化合物的定性筛查和定量检测研究。

吗啡类；氯胺酮；苯丙胺类；液-质联用法

苯丙胺类兴奋剂包括苯丙胺（amphetamine，简写AMP）、甲基苯丙胺（methamphetamine，简写MAMP）、3，4-甲二氧基苯异丙胺（3，4-methylenedioxyamphet⁃amine，简写MDA）、3，4-亚甲二氧基甲基安非他明（3，4-methylenedioxymethamphetamine，简写MDMA）等，具有兴奋中枢神经和周围神经、抑制食欲、致幻等作用，并存在与氯胺酮（Ketamine，简写KET）混合使用情况。吗啡类生物碱主要包括海洛因（Heroin，简写HER）、吗啡（Morphine，简写MOP）、6-单乙酰吗啡（6-Monoacetylmorphine，简写6-MAM）和可待因（Co⁃deine，简写COD）等滥用药物。世界反兴奋剂机构（WA⁃DA）明确规定这些都是运动员需要避免的违禁物质。

另外，公安部《对吸食、注射毒品人员成瘾标准界定》的规定指出，凡查获吸食、注射毒品者，应进行毒瘾司法鉴定和吸毒违法行为的认定。同时，一些吸毒死亡案件中需要对血液进行毒品化合物定性定量分析；交通事故中驾驶者涉嫌服药后的血液毒药物分析等，这些都需要建立灵敏、准确可靠的血液中常见毒品化合物定性定量检测方法。

目前，常见的生物检材有血液[1-3]、尿液[4-7]、头发[8-10]等，检测仪器多为气相色谱仪（GC）[11]、气相色谱-质谱联用仪（GC-MS）[2，9]、高效液相色谱仪（HPLC）[1]、高效液相色谱-质谱联用仪（LC-MS/MS）[4-8，10]等。无论使用何种检材和检测仪器，大多以化合物保留时间、特征碎片离子为指标来定性鉴别。相对于尿液和头发，血液样本存在更多的内源性物质，使得质谱检测中有大量的碎片离子信号干扰，以及在化合物保留时间附近时常出现的“鬼峰”，容易产生假阳性，仅使用上述指标还是难以准确定性鉴别。另外，虽然关于血液中这9种毒品的液质检测方法有文献报道，但都是检测单一化合物或者某一类化合物，尚未见到关于多个和多类毒品化合物同时筛查检测的文献研究。而本研究建立了一种同时对血液中吗啡类、氯胺酮和苯丙胺类等9种毒品化合物进行快速、准确定性定量检测的超高效液相色谱-质谱联用法（UPLC-MS/MS）。实验采用浓度为10%三氯乙酸直接沉淀蛋白来处理血液样本，较之文献中的液-液萃取法和固相萃取法，更加简单快速，提取液不需浓缩复溶，避免了过多中间环节的引入造成系统误差；且成本低，适合大批量样本检测。处理后的样品由超高效液相色谱-质谱仪检测，没有气相色谱-质谱法中的衍生化步骤，也比一般的高效液相色谱-质谱法灵敏，准确度更高，检测周期更短。

1 实验方法

1.1 仪器与试药

1.1.1 仪器

TQD UPLC-MS超高效液相色谱/三重四级杆质谱仪（美国沃特斯有限公司）；可调移液器（法国吉尔森，每年定期计量检定）；SIGMA 3-18K型台式高速冷冻离心机（德国）。

1.1.2 试药

吗啡、6-单乙酰吗啡、可待因、海洛因、氯胺酮、3，4-亚甲二氧基甲基安非他明、3，4-甲二氧基苯异丙胺、苯丙胺、甲基苯丙胺对照品标准液，浓度均为1.00 mg·mL-1，1.0 mL，批号分别为M-005、FE08141515；A-009、FE07141402；C-006、FE10271401；H-038、FE06101301；K-002、FE05091304；M-013、FE043013-02；M-012、FE071612-02；A-007、FE072712-02；A-007、FE072712-02，均由美国Sigma公司提供。甲醇（GR）；三氯乙酸（优级纯）；甲酸（优级纯）；去离子水由超纯水仪（Milli⁃pore纯水系统）制备。

1.2 空白血浆

招募6个健康志愿者，早晨空腹抽取空白血液，置于加有肝素钠抗凝剂的离心管中，5000 r·min-1离心5 min，取上清放入→20℃冰箱冷冻保存。

1.3 仪器条件

1.3.1 色谱条件

色谱柱为Waters ACQUITY UPLC HSS C18柱（2.1 mm×150 mm，1.8 μm）；流动相由含0.01%甲酸的水溶液与含0.01%甲酸的甲醇溶液两相组成，梯度洗脱（0 min～6 min，87：13～60：40；6 min～6.5 min，60：40～10：90）；流速为0.3 mL·min-1；柱温：50℃。

1.3.2 质谱条件

电喷雾离子源，离子源温度120℃，去溶剂化温度350℃；液氮气体流速650 L/hr，毛细管电压（capillary）3.0 kV；采用多反应监测（MRM）方式，正离子扫描分析。

1.4 血浆样品的处理

量取血浆样品200 μL，置于1.5 mL塑料离心管中，加入80 μL 10%三氯乙酸，涡旋混合60 s，4℃13000 r·min-1离心10 min，取上清液供检，进样5 μL。

2 结果与讨论

2.1 色谱条件与质谱分析

2.1.1 色谱条件选择

本研究在预实验中考察了2款色谱柱Waters AC⁃QUITY UPLC HSS PFP柱（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）和Waters ACQUITY UPLC HSS C18柱（2.1 mm×150 mm，1.8 μm）对待测化合物的分离效果，结果后者的分离效果较好。曾采用乙腈-水，乙腈-0.1%的甲酸水作为流动相，结果待测化合物峰形较差，拖尾严重，有的还出现分叉现象；后改为0.01%的甲酸水-0.01%的甲酸甲醇，化合物峰形得到改善，灵敏度也有所提高。

2.1.2 质谱分析

9种化合物的一级质谱分析显示，在ESI正离子模式下都容易得到一个H+，形成较为稳定的[M+H]+准分子离子；通过调节质谱的锥孔电压值（Cone）和碰撞能量（CE）值，9个化合物都会产生多个碎片离子，故每个化合物在筛选时各选取两个特征离子对进行分析，并进一步对其Cone值和CE值进行优化，使离子对响应值最佳。定性分析检测选取两个离子对；定量分析检测选取分子离子峰响应值最高的离子对（表1）。

2.2 提取试剂选择

本在预实验中分别考察了甲醇、乙腈、10%三氯乙酸沉淀蛋白处理血浆样品，结果显示前2种方法处理空白血浆后的提取液检测色谱图中会出现吗啡类化合物峰，表明内源性物质对检测有干扰。采用10%三氯乙酸沉淀蛋白后测定，空白血浆提取液色谱图中没有干扰；同时通过调节流动相比例梯度洗脱，让待测化合物在2 min后出峰，前段时间洗除内源性物质，降低了基质效应的影响，准确度较好。

2.3 方法专属性

取6个不同来源的人空白血浆样品，混合均匀后取200 μL，加入80 μL 10%三氯乙酸，按“1.4”项操作并进样分析。另配制吗啡等9种化合物的质控血浆样品，同法处理分析（n=3）。分别得到人空白血浆色谱图和空白血浆添加对照品色谱图。结果显示，吗啡、可待因、6-单乙酰吗啡、3，4-亚甲二氧基甲基安非他明、3，4-甲二氧基苯异丙胺、苯丙胺、甲基苯丙胺、氯胺酮、海洛因的保留时间分别为2.24、2.77、3.20、3.68、3.63、3.61、3.71、4.84、5.34 min；血浆中内源性物质不干扰以上化合物的测定，见图1。

表1 9种毒品化合物的UPLC-MS/MS条件

2.4 检出限与定量限

取空白人血浆200 μL，加入不同浓度的9种化合物的对照品溶液，配制成一系列质量浓度的样品溶液，按“1.4”项操作并进样分析，得到吗啡、可待因、6-单乙酰吗啡、3，4-甲二氧基苯异丙胺、3，4-亚甲二氧基甲基安非他明、苯丙胺、甲基苯丙胺、氯胺酮、海洛因最低检出限分别为1.00 ng·mL-1、1.00 ng·mL-1、0.50 ng·mL-1、0.10 ng·mL-1、0.10 ng·mL-1、0.10 ng·mL-1、0.10 ng·mL-1、0.50 ng·mL-1和1.00 ng·mL-1；最低定量限分别为2.50 ng·mL-1、2.00 ng·mL-1、1.00 ng·mL-1、0.25 ng·mL-1、0.25 ng·mL-1、0.25ng·mL-1、0.25ng·mL-1、1.00 ng·mL-1和2.00 ng·mL-1。

图1 吗啡（浓度50 ng·mL-1）、可待因（浓度100 ng·mL-1）、海洛因（浓度100 ng·mL-1）、氯胺酮（浓度25 ng·mL-1）、6-单乙酰吗啡（浓度50 ng·mL-1）、3，4-甲二氧基苯异丙胺（浓度10 ng·mL-1）、3，4-亚甲二氧基甲基安非他明（浓度10 ng·mL-1）、苯丙胺（浓度10 ng·mL-1）、甲基苯丙胺（浓度10 ng·mL-1）色谱图

2.5 分子离子峰丰度比

取空白人血浆200 μL，分别配制9种化合物的低、中、高质量浓度的质控样品，按“1.4”项操作并进样分析。用各化合物的一对离子对峰面积与定量的离子对峰面积的比值来计算分子离子峰丰度比。结果表明（表2），9种化合物各自在不同的浓度下分子离子峰丰度比值近似恒定，RSD%均<15%，可作为定性鉴别的一个准确可靠指标。

2.6 标准曲线

在空白血浆中加入不同浓度的9种化合物的对照品工作溶液，配制成一系列浓度的质控血浆样品。按“1.4”项操作并进样分析。以待测物浓度（X）为横坐标，待测物峰面积（Y）为纵坐标，其加权（1/x）线性回归后，得到回归方程。结果显示，吗啡、可待因、海洛因、氯胺酮、6-单乙酰吗啡、3，4-甲二氧基苯异丙胺、3，4-亚甲二氧基甲基安非他明、苯丙胺、甲基苯丙胺回归方程分别为Y=2.07X+7.96（r=0.9934），Y=10.57X+80.99（r=0.9905），Y=41.58X→1.14×102（r=0.9929），Y=51.92X+30.85（r=0.9960），Y=49.03X+2.24×102（r=0.9925），Y=33.20X→7.99（r=0.9910），Y=69.63X→5.95（r=0.9924），Y=33.99X+11.75（r=0.9920），Y=64.16X+18.62（r=0.9900），其质量浓度分别在5.00×10-3～5.00，1.00×10-2～10.00，1.00×10-2～10.00，2.50×10-3～2.50，5.00×10-3～5.00，5.00×10-4～5.00，5.00×10-4～5.00，5.00×10-4～5.00，5.00×10-4～5.00 μg·mL-1内，线性关系均良好。

表2 9种化合物的分子离子峰丰度比

2.7 准确度、精密度和提取回收率

取空白人血浆200 μL，分别配制9种化合物低、中、高质量浓度的质控样品，按血样处理方法进行处理。每个质量浓度5份同日测定，得日内精密度；连续测定3天，得日间精密度。以当日的随行标准曲线计算样品的测定质量浓度，与配制的质量浓度对照，求得方法的准确度。将质控样品与空白血浆提取后加入标准品溶液后进样测得的峰面积相比，考察方法的提取回收率。结果表明，9种化合物的RE<15%，准确度良好；日内、日间精密度（RSD）均<18%；相对提取回收率均>60%，RSD%均<15%，见表3。

表3 9种化合物检测的准确度、精密度与提取回收率

2.8 稳定性

考察9种化合物的低、中、高质量浓度样品经处理后在仪器自动进样室10℃12 h内的稳定性。结果表明，经处理后的9种化合物待测样品在上述条件保持稳定，RE%均小于20%。

2.9 案例分析

收集到2例疑似吸毒人员的血液样本，实验室应用建立的检测方法对这2例样本进行了常见毒品筛查分析。结果显示，2例血液样本中均检测到化合物甲基苯丙胺，其含量分别为0.58 μg·mL-1和4.87 μg·mL-1。

3 总结

本研究考察了9种化合物各自在不同的浓度下分子离子峰丰度比，发现丰度比值近似恒定，从量的角度排除了内源性物质和系统色谱“鬼峰”的干扰，是一个非常准确可靠的专属性很强的定性指标。故可用保留时间、特征碎片离子峰及分子离子峰丰度比为指标来定性鉴别血液样品中这9种常见毒品，同时也为生物样本中其他类别药物化合物的定性鉴别提供参考。另外，本文方法学考察结果表明，准确度、线性、提取率和精密度均良好，检测限和定量限在ng·mL-1级，能够对血液样品中这9种毒品进行准确定量测定。

综上，本实验建立的人血浆中吗啡、可待因、海洛因、氯胺酮、6-单乙酰吗啡、3，4-甲二氧基苯异丙胺、3，4-亚甲二氧基甲基安非他明、苯丙胺、甲基苯丙胺的超高效液相色谱-质谱法具有分析时间短、操作简便、准确度和灵敏度较高、重复性好等特点，在10 min内可完成一个样品多个成分的定性定量分析，适合大批样本，成本低、能够满足实际检测需要。另外，目前常见毒品除上述9种外，还包括美沙酮、氢化吗啡、氧可酮、大麻类等，以及一些新型毒品，以后实验室将继续对这些化合物的检测方法进行研究。

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Simultaneous Identification and Quantification of 9 Drugs of Opiates，Ketamine and Amphetamines in Human Plasma Using UPLC-MS/MS for Doping Control

Wang Wei1，Qiao Shi1，Zhang Wenfang2，Qin Shiyang2，Li Qingyan1
1 Civil Aviation Medical Center（Civil Aviation General Hospital），Civil Aviation Administration of China，Beijing 100123，China 2 The Criminal Investigation Department of Beijing Public Security Bureau，Beijing 100085，China Corresponding Author:Li Qingyan，Email:qingyan.ye.li@gmail.com

ObjectiveTo develop the method for simultaneous identification and quantification of mor⁃phine，6-monoactylmorphine，codeine，heroin，ketamine，3，4-Methylenedioxyamphetamine（MDA），3，4-meth⁃ylenedioxymethamphetamine（MDMA），amphetamine and methylamphetamine in human plasma.MethodsUPLC-MS/MS was adopted to analyze plasma with protein precipitated using 10%trichloroacetic acid.Plasma samples were separated on ACQUITY UPLC HSS C18 column with aqueous solution（0.01%formic acid）-methanol（0.01%formic acid）as the mobile phase，and at a flow rate of 0.3 mL·min-1.The multiple reaction monitoring（MRM）mode was performed combined with the positive ion mode for quantification in four sections.ResultsThe retention time，the characteristic fragment ions，and the rela⁃tive abundance ratio of the molecular ion peak could be used to identify these nine compounds sensi⁃tively.The liner calibration curve of morphine，codeine，heroin，ketamine，6-monoacetylmorphine，MDA，MDMA，amphetamine and methamphetamine were obtained in the concentration range of 5.00×10-3～5.00（r=0.9934），1.00×10-2～10.00（r=0.9905），1.00×10-2～10.00（r=0.9929），2.50×10-3～2.50（r=0.9960），5.00×10-3～5.00（r=0.9925），5.00×10-4～5.00（r=0.9910），5.00×10-4～5.00（r=0.9924），5.00×10-4～5.00（r=0.9920）and 5.00×10-4～5.00 μg·mL-1（r=0.9900）respectively.The lowest detection limit was 1.00，1.00，1.00，0.50，0.50，0.10，0.10，0.10 and 0.10 ng·mL-1respectively.The relative standard devia⁃tion（RSD）of the inter-day and intra-day were less than 18%.The relative recovery was more than 60%，and the RSD were less than 15%.ConclusionThe method is accurate，sensitive and suitable for identification and quantification of 9 drugs of opiates，ketamine and amphetamines in human plasma.

opiates，ketamine，amphetamines，UPLC-MS/MS

2016.11.23

中国民用航空局民航安全能力建设资金项目（DFS20160604）

第1作者：王伟，Email:xinyuok2@163.com；

李清艳，Email：qingyan.ye.li@gmail.com