PI3K/Akt/eNOS信号通路在葛根素抑制ox-LDL诱导的血管内皮细胞组织因子表达中的作用*

邓华菲， 李 坚， 周 琴， 谭玉林， 谢 明， 张天杰， 韩 瑛， 张文龙

(1湘南学院基础医学院， 2郴州市第一人民医院神经内科， 湖南 郴州 423000)

PI3K/Akt/eNOS信号通路在葛根素抑制ox-LDL诱导的血管内皮细胞组织因子表达中的作用*

邓华菲1， 李 坚1， 周 琴1， 谭玉林1， 谢 明1， 张天杰1， 韩 瑛1， 张文龙2△

(1湘南学院基础医学院，2郴州市第一人民医院神经内科， 湖南 郴州 423000)

目的： 探讨磷脂酰肌醇 3-激酶/蛋白激酶B/内皮型一氧化氮合酶(PI3K/Akt/eNOS)信号通路在葛根素(puerarin)抑制氧化型低密度脂蛋白(oxidized low-density lipoprotein， ox-LDL)诱导的血管内皮细胞组织因子(tissue factor，TF)表达中的作用。方法: 实时荧光定量PCR检测TF的mRNA表达，Western blot检测TF和Akt的蛋白表达，硝酸盐还原酶法检测一氧化氮(nitric oxide， NO)含量。结果: 与对照组相比，ox-LDL孵育内皮细胞后，内皮细胞TF的mRNA和蛋白表达升高，Akt蛋白磷酸化水平降低，细胞内NO产生减少；而葛根素预孵育内皮细胞1 h后，再用ox-LDL孵育，内皮细胞TF mRNA和蛋白表达下降，Akt蛋白磷酸化升高，细胞内NO产生增多；PI3K抑制剂LY294002和葛根素共同预孵育内皮细胞1 h后，再用ox-LDL孵育，内皮细胞TF的mRNA和蛋白表达升高，Akt蛋白磷酸化降低，细胞内NO产生减少；eNOS抑制剂NG-硝基-L-精氨酸甲酯(L-NAME)和葛根素共同预孵育内皮细胞，也明显阻断葛根素对ox-LDL诱导的内皮细胞TF mRNA和蛋白表达、细胞Akt蛋白磷酸化和细胞内NO产生的作用。结论: 葛根素可通过上调PI3K/Akt/eNOS信号通路抑制ox-LDL诱导的人脐静脉内皮细胞TF mRNA和蛋白表达。

葛根素； 氧化型低密度脂蛋白； 组织因子； PI3K/Akt/eNOS信号通路； 血管内皮细胞

冠状动脉粥样硬化斑块破裂导致血栓形成是急性冠脉综合征(acute coronary syndrome，ACS)最主要的发病机制。组织因子(tissue factor，TF)即凝血因子Ⅲ，是启动体内凝血过程的重要因子。Emekli-Alturfan等[1]研究发现，与稳定性心绞痛患者和正常人相比，ACS患者血浆中TF抗原水平及其活性明显升高(血浆TF水平常常作为ACS患者预后的重要指标[2])。正常情况下，血管内皮细胞和外周血细胞中测不到TF，故正常血液循环中不存在凝血的启动，但在病理条件下血管内皮细胞可诱发性表达TF，特别是血管内皮细胞受到损伤或炎性因子刺激时TF表达显著增多[3-4]，增加动脉血栓及粥样硬化危险。

氧化型低密度脂蛋白(oxidized low-density lipoprotein，ox-LDL)作为独立的危险因素在动脉粥样硬化(atherosclerosis，As)的发生发展过程及ACS的形成中占有重要地位, ox-LDL不仅可以损伤血管内皮细胞，使其由抗凝血向促凝血方向转化，还能诱导血管内皮细胞表达TF[4]。ox-LDL诱导内皮细胞TF表达的信号转导机制尚不完全清楚。实验研究表明磷脂酰肌醇 3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase, PI3K)-蛋白激酶B(protein kinaseB，PKB/Akt)负调控内皮细胞TF表达[5]。Akt磷酸化内皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase，eNOS)中第 1 177 位丝氨酸可使该酶活化，促进一氧化氮(nitric oxide，NO)产生。NO是强有力的血管舒张剂，能够抑制平滑肌细胞增殖和血小板聚集，也能抑制TF在内皮细胞中的表达[6]。

葛根素(puerarin，Pue)是从干燥葛根中提取的一种异黄酮类化合物，具有明显的抗动脉粥样硬化[7]、保护血管内皮细胞和心肌细胞[8-9]、对抗铅对肾脏的损伤[10]、影响骨的增殖和分化[11]、促进胰腺β细胞生存[12]的作用，这些保护作用与PI3K/Akt/eNOS信号通路有关[7-12]。近年来有学者研究发现葛根素能降低ACS患者外周血TF的表达水平[13]；汪自龙等[14]进一步发现葛根素能降低ACS患者体外单核源巨噬细胞TF的表达，并降低其活性；冉文卓等[15]研究表明葛根素可呈剂量和时间依赖性地抑制血管紧张素Ⅱ诱导的TF表达。目前本实验室已研究发现葛根素能抑制ox-LDL对TF的诱导作用(另文发表)，但是其机制尚不清楚，为此我们以人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVECs)为研究对象，观察PI3K/Akt/eNOS信号途径是否介导了葛根素抑制ox-LDL诱导的TF表达，进一步探索葛根素对凝血系统活性的调控机制，为干预As血栓形成提供新的思路。

材 料 和 方 法

1 主要试剂和材料

葛根素购自Sigma； ox-LDL购自上海翊圣生物科技有限公司；PI3K抑制剂LY294002和eNOS抑制剂NG-硝基-L-精氨酸甲酯(NG-nitro-L-arginine methyl ester，L-NAME)购自Selleck；Trizol、cDNA合成试剂盒和SYBR荧光定量试剂盒分别购自Invitrogen、Fermentas和ABI；TF抗体购自Abcam； β-actin抗体购自Santa；Akt和p-Akt(Thr308)抗体购自CST；细胞蛋白抽提试剂盒购自碧云天生物技术有限公司；BCA蛋白定量试剂盒和增强化学发光(ECL)试剂盒购自Pierce；胰蛋白酶和胎牛血清购自杭州四季青公司；TF和β-actin引物由上海生工生物工程有限公司合成。

2 方法

2.1 细胞培养和实验分组 以含10%胎牛血清的DMEM细胞培养基培养HUVECs(中南大学湘雅医学院实验中心提供，内皮细胞特异性标志CD31阳性率≥95%)，每2～3 d更换细胞培养液并传代，取处于对数生长期的细胞用于实验。

实验分组：正常对照(control)组：用含10%胎牛血清的DMEM培养HUVECs 24 h；ox-LDL组：用含ox-LDL(终浓度为50 mg/L)的DMEM孵育HUVECs 24 h；ox-LDL+葛根素组(ox-LDL+Pue组)：100 μmol/L葛根素预处理HUVECs 1 h后，再用50 mg/L ox-LDL孵育HUVECs 24 h；PI3K抑制剂组(LY294002组)：用PI3K抑制剂LY294002(10 μmol/L)和葛根素预处理HUVECs 1 h后，再加入50 mg/L ox-LDL处理HUVECs 24 h；eNOS抑制剂组(L-NAME组)：用eNOS抑制剂L-NAME(100 μmol/L)和葛根素处理HUVECs 1 h后，再加入50 mg/L ox-LDL处理HUVECs 24 h。

2.2 实时荧光定量PCR检测TF的mRNA表达 Trizol提取细胞总RNA后融于无RNase水中，用紫外分光光度计检测RNAA260/A280的比值并计算其浓度。用M-MuLV反转录酶将RNA合成cDNA后进行扩增。人TF的上游引物序列为5’-GCCAAGATGTACCTGGGCTA-3’，下游引物序列为5’-CATTCATGATCTTGGCGATG-3’，产物长度为220 bp；内参照采用β-actin，上游引物序列为5’-CATTAAGGAGAAGCTGTGCT-3’，下游引物序列为5’-GTTGAAGGTAG TTTCGTGGA-3’，产物长度为208 bp。SYBR Green法进行实时荧光定量PCR反应。反应条件为： 94 ℃ 20 s， 60 ℃ 20 s， 72 ℃ 20 s，共40个循环； 72 ℃ 5 min。用CFX Manager软件分析得到Ct值，经β-actin校正，以校正值2-ΔΔCt进行统计分析。ΔCt = Ct目的基因-Ct内参基因，ΔΔCt =ΔCt刺激组-ΔCt对照组(相对定量以含量最低的样本为标准，其余各样本的含量均为相对该样本的倍数)。

2.3 Western blot实验 冰上提取细胞总蛋白后用BCA法定量各样本蛋白浓度。蛋白样品加入5×SDS上样缓冲液后煮沸变性，每孔加入20 μg蛋白，经10% SDS-PAGE后，蛋白被转移至硝酸纤维素膜上，用含5%脱脂奶的TBST封闭2 h，然后分别与抗TF抗体(1∶1 000)、p-Akt抗体(1∶1 000)、Akt抗体(1∶1 000)和β-actin抗体(1∶800)4 ℃ 孵育过夜；充分洗膜后加入辣根过氧化物酶标记的 II 抗(1∶4 000) 继续孵育；再次洗膜后化学发光法显影，对各条带的灰度值扫描，以β-actin作为内参照，计算各样本蛋白含量。

2.4 硝酸盐还原酶法检测细胞内NO含量 收集培养的各组细胞，用细胞裂解液裂解细胞，硝酸盐还原酶法检测细胞内NO含量，按NO检测试剂盒说明，分光光度计于540 nm波长处测定各样本吸光度值，并用BCA蛋白定量试剂盒检测细胞内蛋白含量，计算单位蛋白中所含NO。

3 统计学处理

所有数据用均数±标准差(mean±SD)表示，结果用GraphPad Prism 6软件进行统计分析和图形绘制。多组间比较用单因素方差分析(one-way ANOVA)，各组间差异的两两比较用Student-Newman-Keuls检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 葛根素抑制ox-LDL诱导TF mRNA和蛋白的表达

如图1所示，50 mg/L ox-LDL处理HUVECs 24 h后，TF的mRNA和蛋白的表达明显高于正常对照组(P<0.01)；而用100 μmol/L葛根素预处理HUVECs 1 h后，再用50 mg/L ox-LDL孵育HUVECs 24 h，明显减弱了ox-LDL诱导TF mRNA和蛋白表达的作用(P<0.01)。这些结果表明，葛根素抑制了ox-LDL诱导的HUVECs TF表达。

2 PI3K抑制剂和eNOS抑制剂对葛根素降低ox-LDL诱导的TF mRNA和蛋白表达的影响

有研究表明，PI3K-Akt信号通路对TF表达起负调控作用[5]，因此我们探讨了葛根素是否通过活化PI3K-Akt通路抑制ox-LDL诱导TF表达。结果发现，PI3K抑制剂LY294002(10 μmol/L)和葛根素处理HUVECs 1 h后，再加入50 mg/L ox-LDL处理内皮细胞24 h，葛根素对ox-LDL诱导的TF mRNA和蛋白表达的作用明显被抑制。NO可以抑制微血管内皮细胞TF表达[6]，因此我们也探讨了葛根素是否通过增加NO的产生抑制ox-LDL诱导的TF表达。eNOS抑制剂L-NAME和葛根素处理HUVECs 1 h后，再加入50 mg/L ox-LDL处理内皮细胞24 h，葛根素对ox-LDL诱导的TF mRNA和蛋白的作用被阻断，见图1。

Figure 1.The effects of various drugs on ox-LDL-induced TF mRNA (A) and protein (B) expression in HUVECs determined by real-time quantitative PCR and Western blot, respectively. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vsox-LDL group;#P<0.05,##P<0.01vsPue+ox-LDL group.

图1 不同药物对ox-LDL诱导的HUVECs TF mRNA和蛋白水平表达的影响

3 葛根素和LY294002对ox-LDL抑制内皮细胞Akt蛋白磷酸化的影响

为了探讨PI3K-Akt通路是否参与葛根素抑制ox-LDL诱导TF表达，本实验进一步检测了各组细胞Akt蛋白的磷酸化。结果发现，与正常对照组相比，50 mg/L ox-LDL处理HUVECs 24 h后，Akt蛋白磷酸化明显下降(P<0.01)；而用100 μmol /L葛根素预处理HUVECs 1 h，再用50 mg/L ox-LDL处理24 h，明显减弱了ox-LDL对Akt蛋白磷酸化的抑制作用(P<0.01)；PI3K抑制剂LY294002明显逆转了葛根素的上述作用，见图2。这些结果表明，ox-LDL通过抑制PI3K-Akt通路诱导了TF的表达，而葛根素减弱了ox-LDL对PI3K-Akt通路的抑制作用，从而抑制了TF的表达。

Figure 2.The effect of puerarin and LY294002 on the inhibition of Akt phosphorylation induced by ox-LDL in the HUVECs. Akt protein was determined by Western blot. Mean±SD.n=3.**P<0.01vsox-LDL group;##P<0.01vsPue+ox-LDL group.

图2 葛根素和LY294002对ox-LDL抑制HUVECs 的Akt蛋白磷酸化的影响

4 葛根素、LY294002和L-NAME对ox-LDL抑制内皮细胞NO生成的影响

为了探讨葛根素是否通过增加NO的产生抑制ox-LDL诱导TF表达，本实验检测了各组细胞内NO的含量。与正常对照组相比，50 mg/L ox-LDL处理HUVECs 24 h后，细胞内NO的产生明显减少(P<0.01)；用100 μmol /L葛根素预处理HUVECs 1 h，再用50 mg/L ox-LDL处理HUVECs 24 h，细胞内NO的含量明显增加(P<0.01)。eNOS抑制剂L-NAME逆转了葛根素的效应，可见，NO的产生参与了葛根素降低ox-LDL对TF表达的诱导作用。同时，PI3K抑制剂LY294002也逆转了葛根素降低ox-LDL对NO的抑制作用，因此，PI3K/Akt/eNOS信号通路参与了葛根素对ox-LDL诱导HUVECs TF mRNA和蛋白表达的抑制作用，见图3。

Figure 3.The effect of puerarin, LY294002 and L-NAME on the inhibition of NO production induced by ox-LDL in the HUVECs. Intracellular NO content was determined by nitrate reduction method. Mean±SD.n=3.**P<0.01vsox-LDL group;##P<0.01vsPue+ox-LDL group.

图3 葛根素、LY294002和L-NAME对ox-LDL抑制内皮细胞产生NO的影响

讨 论

As是ACS的重要病理基础，而血栓的形成在As的形成和发展过程中起着重要作用。TF是外源性凝血途径的关键因子，影响急性心肌梗死的过程，由于绝大多数的心肌梗死是因不稳定斑块的破裂，继而引起出血和管腔内血栓形成，而导致管腔闭塞，引起相应动脉部位的病变。生理状态下，血管内皮细胞并不表达TF，但是炎症因子、ox-LDL等刺激可以诱导血管内皮细胞表达TF[3-4]。本实验用50 mg/L ox-LDL孵育HUVECs 24 h后，细胞TF的mRNA和蛋白表达明显增加，与上述研究结果一致。

ox-LDL对血管内皮细胞TF表达的诱导机制尚不完全清楚。有研究报道，PI3K/Akt是血管内皮细胞TF的负调控信号通路[5]。研究发现，PI3K抑制物wortmannin和LY294002孵育HUVECs，加强了VEGF对TF的诱导作用[16]；Akt去磷酸化还能促进凝血酶诱导TF表达[17]。本实验发现50 mg/L ox-LDL孵育HUVECs 24 h后，细胞内Akt蛋白磷酸化降低，TF的mRNA和蛋白表达明显增加，进一步证实PI3K/Akt负调控TF的表达。Akt磷酸化后可以促进eNOS活化，使细胞产生NO增多，而NO具有抑制血小板聚集和TF产生的作用[6]。本实验发现50 mg/L ox-LDL使HUVECs内NO产生减少而TF表达增加，由此可以得出抑制PI3K/Akt/eNOS信号通路促进了ox-LDL诱导TF的表达。

葛根中的主要有效成分葛根素的化学名为4，7-二羟基-8-D-葡萄糖基异黄酮，具有多种药理学作用[8-12]，其机制与PI3K/Akt/eNOS信号通路有关。临床和实验室研究发现，葛根素具有调节ACS患者外周血TF表达[13-14]、抑制血管紧张素Ⅱ诱导的TF表达[15]的作用。本实验研究发现，葛根素能抑制ox-LDL诱导HUVECs TF mRNA和蛋白的表达；同时，葛根素减弱了ox-LDL对Akt的蛋白磷酸化抑制作用，使细胞内NO产生增加；而PI3K抑制物LY294002逆转了葛根素的效应，细胞内TF mRNA和蛋白表达增高，Akt蛋白磷酸化减弱，NO产生减少；eNOS抑制剂L-NAME也取消了葛根素抑制ox-LDL对TF mRNA和蛋白表达的诱导作用，细胞内NO的产生也明显减少。这些结果提示，葛根素通过上调PI3K/Akt/eNOS信号通路降低了ox-LDL对TF mRNA和蛋白表达的诱导作用。

总的来说，本研究进一步发现PI3K/Akt/eNOS信号通路可负调控ox-LDL诱导血管内皮细胞TF表达，而葛根素通过上调PI3K/Akt/eNOS信号通路降低了ox-LDL对TF mRNA和蛋白表达的诱导作用。

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(责任编辑： 林白霜， 罗 森)

Role of PI3K/Akt/eNOS signaling pathway in inhibitory effects of puerarin on ox-LDL-induced TF expression in vascular endothelial cells

DENG Hua-fei1, LI Jian1, ZHOU Qin1, TAN Yu-lin1, XIE Ming1, ZHANG Tian-jie1, HAN Ying1, ZHANG Wen-long2

(1BasicMedicalCollege,XiangnanUniversity,2DepartmentofNeurology,TheFirstPeopleHospitalofChenzhou,Chenzhou423000,China.E-mail:zhangwenlong72@126.com)

AIM: To explore the role of phosphatidylinositiol 3-kinase/protein kinase B/endothelial nitric oxide synthase (PI3K/Akt/eNOS) signaling pathways in the inhibitory effects of puerarin on oxidized low-density lipoprotein (ox-LDL)-induced tissue factor (TF) expression in vascular endothelial cells. METHODS: The mRNA expression of TF was detected by real-time fluorescent quantitative PCR. The protein levels of TF and Akt was determined by Western blot. The content of the nitric oxide (NO) was measured by nitrate reduction method. RESULTS: Compared with control group, incubating endothelial cells with ox-LDL significantly induced TF expression at mRNA and protein levels and the dephosphorylation of Akt protein, and decreased NO production. Incubation of the endothelial cells with puerarin for 1 h and then treatment of the cells with ox-LDL decreased the TF expression at mRNA and protein levels, increased Akt protein phosphorylation and intracellular NO content. Co-incubation of the endothelial cells with PI3K inhibitor LY294002 and puerarin for 1 h and then treatment of the cells with ox-LDL augmented the TF expression at mRNA and protein levels and the Akt protein dephosphorylation, and decreased NO production. Co-incubation of the endothelial cells with eNOS inhibitorNG-nitro-L-arginine methyl ester (L-NAME) and puerarin significantly decreased the inhibitory effect of puerarin on ox-LDL-induced TF expression at mRNA and protein levels in the endothelial cells, and reduced Akt protein phosphorylation and NO production. CONCLUSION: Puerarin inhibits ox-LDL-induced TF expression at mRNA and protein levels in the human umbilical vein endothelial cells via activation of PI3K/Akt/eNOS signaling pathway.

Puerarin; Oxidized low-density lipoprotein; Tissue factor; PI3K/Akt/eNOS signaling pathway; Vascular endothelial cells

1000- 4718(2017)07- 1214- 05

2016- 12- 15

2017- 03- 13

湖南省教育厅资助科研项目(No. 13K113，11C1179)；湘南学院科研基金资助项目(No. 2015XB18)；湖南省卫生计生委科研计划课题项目资助(No. B2017043)；湖南省重点建设学科资金资助项目(湘教发 [2011] 76 号)；湖南省郴州市科技局项目(No. [2011]29)；湘南学院重点建设学科资金资助项目(No. XNU-125-KD-019)

R965； R363.2+1

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.07.010

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△通讯作者 Tel： 0735-2343191； E-mail： zhangwenlong72@126.com