EPO通过激活PI3K/Akt途径上调HSP70的表达对低温下心衰大鼠起保护作用*

邓琴琴， 王梦洪， 裴兆辉

(1南昌市第三医院心内二科， 江西 南昌 330009； 2南昌大学第一附属医院心内科， 江西 南昌 330006)

EPO通过激活PI3K/Akt途径上调HSP70的表达对低温下心衰大鼠起保护作用*

邓琴琴1， 王梦洪2 △， 裴兆辉1

(1南昌市第三医院心内二科， 江西 南昌 330009；2南昌大学第一附属医院心内科， 江西 南昌 330006)

目的： 评价红细胞生成素(erythropoietin，EPO)对低温环境下心衰大鼠的影响，探讨其可能的作用机制。方法: 80只SD大鼠随机分5组，分别为对照组(CON组)、心衰低温组(HFLT组)、心衰常温组(HFNT组)、心衰低温EPO组(HFLT+EPO组)和心衰低温LY294002组(HFLT+EPO+LY组)。然后将所有大鼠放置于气候箱中(CON、HFLT、HFLT+EPO和HFLT+EPO+LY组为低温环境；HFNT组为常温)。超声心动图检测各组大鼠心功能，然后处死大鼠并留取心脏标本，TUNEL法测心肌细胞凋亡，荧光定量PCR测心肌组织中Fas和PI3K mRNA的表达，Western blot测大鼠心肌组织中热休克蛋白70(HSP70)、Akt和p-Akt的水平。结果: 低温下心衰大鼠心功能明显低于常温下心衰大鼠，HFLT+EPO组大鼠心功能较HFLT组明显改善，给予LY294002干预后HFLT+EPO+LY组大鼠心功能明显低于HFLT+EPO组；HFLT组及HFNT组凋亡指数均高于CON组(P<0.01)，HFLT组凋亡指数又明显高于HFNT组(P<0.05)，HFLT+EPO组凋亡指数明显低于HFLT组(P<0.01)。Fas mRNA在HFLT组心肌组织中的表达明显高于HFNT组，PI3K mRNA在HFLT组和HFNT组心肌组织中的表达差异无统计学显著性，HFLT+EPO组心肌组织中Fas的mRNA表达明显低于HFLT组(P<0.01)和HFLT+EPO+LY组(P<0.05)，而PI3K的mRNA表达则明显高于HFLT组和HFLT+EPO+LY组(P<0.05)。HFLT+EPO组大鼠心肌组织中p-Akt和HSP70的水平明显高于HFLT组和HFLT+EPO+LY组(P<0.05)，CON、HFLT和HFNT组大鼠心肌组织中p-Akt和HSP70的蛋白水平差异无统计学显著性。所有大鼠心肌组织中Akt的水平差异无统计学显著性。结论: EPO活化PI3K/Akt后，上调内源性保护途径中HSP70的表达并抑制细胞凋亡，从而对低温下的心衰大鼠心脏起保护作用。

红细胞生成素； 低温； 心力衰竭； PI3K/Akt信号通路

大量研究表明低温会加重心力衰竭(heart fai-lure，HF)患者的临床症状，增加住院率和死亡率[1-2]。研究表明加重的原因可能与低温引起的感冒有关[3]。为进一步增加心衰患者对低温的抵抗力，需要寻找新的药物进一步改善患者的心功能。红细胞生成素(erythropoietin，EPO)具有促进造血、抗凋亡、抗炎、促干细胞迁移等多种功能，最近发现其对心肌细胞尚有保护作用，但EPO在低温环境下对心肌细胞是否具有保护作用研究甚少，本实验使用心衰大鼠模型研究EPO对低温环境下心衰大鼠是否起保护作用，并通过抑制磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K)/Akt途径探讨EPO对低温环境下心衰大鼠的作用机制。

材 料 和 方 法

1 材料

1.1 动物 健康雄性纯种SD大鼠80只，体重250～270 g，由上海西普尔-必凯实验动物有限公司提供。

1.2 试剂及仪器 TRIzol RNA抽提试剂盒、逆转录试剂盒及Real Master Mix均购自天根公司；TUNEL试剂盒、LY294002及二甲基亚砜均购自Promega；阿霉素及EPO均购自Sigma；兔抗热休克蛋白70(heat shock protein 70，HSP70)单克隆抗体及羊抗Akt、p-Akt单克隆抗体均购自Abcam；小鼠抗β-actin单克隆抗体及HRP标记的 II 抗均购自北京中杉金桥公司；ECL超敏发光剂为Thermo产品；蛋白抽提试剂盒购自北京普利来公司。751-GM紫外分光光度计(上海惠普分析仪器有限公司)；超低温冰箱(青岛海尔集团公司)；水平电泳槽、垂直板蛋白电泳装置(Bio-Rad)；荧光定量PCR仪(Beckman)；显微镜(Olympus)；台式低温高速离心机(Heraeus)；蛋白转移装置(北京六一仪器厂)；气候箱(南京艾赛特科技发展有限公司)。

2 方法

2.1 动物模型的建立及分组 雄性SD大鼠80只，体重250～270 g，随机分5组：对照(control，CON)组8只；心衰低温(heart failure in low temperature，HFLT)组20只；心衰常温(heart failure in low temperature，HFNT)组20只；心衰低温EPO组(HFLT+EPO组)14只；心衰低温LY294002(LY)组(HFLT+EPO+LY组)18只。(1) HFLT、HFNT、HFLT+EPO和HFLT+EPO+LY组均予腹腔注射阿霉素制作大鼠心衰模型(每周2次，每次2.5 mg/kg，共5周)，CON组予同体积的生理盐水5周； (2) 造模后，HFLT+EPO+LY组尾静脉注射LY294002(0.3 mg·kg-1·d-1)，CON、HFLT、HFNT和HFLT+EPO组均予尾静脉注射同体积的生理盐水；30 min后，HFLT+EPO和HFLT+EPO+LY组腹腔注射EPO(4 000 U·kg-1·d-1)，CON、HFLT和HFNT组均予同体积的生理盐水；然后将所有大鼠放置于气候箱中(CON、HFLT、HFLT+EPO和HFLT+EPO+LY组为4 ℃，3 h；HFNT组温度与外界温度相同，3 h)，整个过程重复4 d。

2.2 超声心动图检查 选用GE Vivid 7彩色多谱勒超声诊断仪，高频探头(12 MHz)，宽频线阵，Gain 50 dB，深度2.5 cm。置于气候箱后2 h进行，腹腔注射3%戊巴比妥钠麻醉，仰卧固定于木板上，胸部脱毛，接心电图，取大鼠胸骨旁左室长轴切面测量左室舒张末期内径(left ventricular internal dimension at end-diastole ，LVIDd)、左室收缩末期内径(left ventricular internal dimension at end-systole，LVIDs)、射血分数(ejection fraction，EF)和缩短分数(fractional shortening，FS)。

2.3 Western blot实验检测心肌组织中HSP70、p-Akt和Akt的水平 称取100 mg大鼠心肌组织剪碎，加入1 mL的裂解液匀浆(所有步骤均在冰上操作)。10 000×g离心10 min 后加入蛋白抽提试剂2 mL。10 000×g离心10 min后。溶液分为2层，中间为一层白色的蛋白膜。去除蛋白膜上下两层液体，室温干燥5 min，加入300 μL 4% SDS及300 μL 2×上样缓冲液充分混匀，95 ℃加热变性10 min。取制备的蛋白样品12 μL进行10% SDS-PAGE,蛋白分离后电转移至NC膜，5%脱脂奶粉封闭1 h ；分别加入抗HSP70、p-Akt、Akt、α-actin 等 I 抗(除HSP70为1∶10 000外，其余均为1∶400稀释)，4 ℃孵育过夜；辣根过氧化物酶标记的 II 抗孵育4 h。用ECL发光剂，暗室曝光后凝胶成像系统进行图像分析处理。

2.4 TUNEL法检测心肌细胞凋亡 实验步骤严格按照细胞凋亡原位检测试剂盒说明书进行。左心室组织固定、包埋、切片；脱蜡；体积分数0.3%的H2O2封闭30 min；20 mg/L蛋白酶K消化膜蛋白及核蛋白；加TUNEL反应液，37 ℃孵育70 min；加入抗荧光素抗体；DAB显色，苏木精复染，脱水透明，封片。以不加TdT酶者为阴性对照，分别以用Dnase1(10 mg/L)消化的左心室心肌切片为阳性对照。正常心肌细胞核呈蓝色，凋亡心肌细胞核呈棕黄色。每只大鼠观察4张切片，每张切片在40倍视野下，随机计数5个不同视野的凋亡细胞及细胞总数，计算凋亡细胞数占总细胞的百分率即凋亡指数(apoptotic index，AI)。

2.5 荧光定量PCR测定心肌Fas和PI3K的mRNA表达 取100 mg左右的心肌组织加入约1 mL TRIzol，用RNA 提取试剂盒提取心肌总RNA，随后按逆转录试剂盒说明进行逆转录合成cDNA。引物序列由上海捷瑞生物技术有限公司合成。Fas 的上游引物为5’-CGCCTATGGTTGTTGACC-3’，下游引物为5’-CTCCAGACATTGTCTCC-3’，扩增片段为477 bp；PI3K的上游引物为5’-AGATGCTTTCAAACGCTAT-3’；下游引物为5’-GCTGTCGCTCACTCCA-3’，扩增片段为359 bp；GAPDH的上游引物为5’-AGGCCGGCTTCGCGGGCG-3’，下游引物为5’-CTCGGGAGCCACACGCAG-3’，产物为450 bp。在ABI 7500型全自动实时荧光定量PCR仪上扩增并检测荧光。扩增参数： 94 ℃ 2 min； 94 ℃ 30 s， 53 ℃ 30 s， 72 ℃ 30 s， 35个循环； 72 ℃ 7 min。反应结束后，进行熔解曲线的测定，反应条件： 95 ℃ 15 s， 60 ℃ 1 min， 95 ℃ 15 s。

3 统计学处理

用SPSS 14.0 统计软件对所得结果进行处理，计量资料用均数±标准差(mean±SD)表示，组间比较采用单因素方差分析和SNK-q检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 实验动物存活评价

实验末存活大鼠50只，其中CON组8只，HFLT组和HFLT+EPO组剩9只，HFLT+EPO+LY组余10只，HFNT组剩14只。11只大鼠在造模期间死于心力衰竭，其中CON组无死亡，HFLT、HFNT、HFLT+EPO和HFLT+EPO+LY组分别死亡3、4、2和2只，另有19只死于气候箱中，CON组无死亡，HFLT、HFNT、HFLT+EPO和HFLT+EPO+LY组各分别死亡8、2、3和6只。

2 心脏超声测定结果

与CON组相比，HFLT组经阿霉素处理后，LVIDd和LVIDs明显增加(P<0.01)，EF和FS明显降低(P<0.01)；与HFNT组相比，HFLT组LVIDd、LVIDs增加(P<0.05)，EF和FS降低(P<0.05)，显示低温能进一步使心功能恶化；与HFLT组相比，HFLT+EPO组的EPO处理能降低LVIDd和LVIDs(P<0.01)，增加EF和FS(P<0.01)；与HFLT+EPO组相比，HFLT+EPO+LY组LVIDd和LVIDs减低(P<0.05)，EF和FS增加(P<0.05)，见图1、表1。

3 TUNEL法测定结果

光镜下CON组偶见凋亡细胞，凋亡指数为4.21±0.88，HFLT、HFNT、HFLT+EPO和HFLT+EPO+LY组均可见明显凋亡细胞(其细胞核为棕褐色)，凋亡指数分别为28.79±3.10、23.56±2.20、11.45±1.50和24.63±2.33。CON组无明显心肌细胞凋亡，HFLT组及HFNT组均有明显的细胞凋亡，且凋亡指数均高于CON组(P<0.01)，HFLT组凋亡指数又明显高于HFNT组(P<0.05)，HFLT+EPO组凋亡指数明显低于HFLT组(P<0.01)，见图2。

Figure 1.Ultrasonic cardiogram of the rats in each group.

图1 超声心动图检测5组SD大鼠心脏功能的超声心动图

表1 各组SD大鼠心功能指标情况

LVIDd: left ventricular internal dimension at end-diastole; LVIDs: left ventricular internal dimension at end-systole; EF: ejection fraction; FS: fractional shortening.**P< 0. 01vsCON;#P<0.05，##P<0.01vsHFLT;△P<0.05vsHFLT+EPO.

Figure 2.Apoptosis of left ventricular myocardial tissues from the rats in each group (TNUEL, the scale bar=20 μm). Mean±SD.n=4.*P<0.01vsCON;#P<0.05，##P<0.01vsHFLT;△P<0.05vsHFLT+EPO.

图2 TUNEL法检测5组SD大鼠左室心肌细胞凋亡情况

4 qPCR检测结果

与CON组相比，HFLT组Fas的mRNA表达明显增加(P<0.01)，PI3K的mRNA表达下降(P<0.01)；与HFNT组相比，HFLT组的低温处理能提高Fas的mRNA表达(P<0.05)，但对PI3K的mRNA表达无影响；与HFLT组相比，HFLT+EPO组的EPO处理能降低Fas的mRNA表达(P<0.01)，增加PI3K的mRNA表达(P<0.01)；与HFLT+EPO组相比，HFLT+EPO+LY组Fas的mRNA表达增加(P<0.05)，PI3K的mRNA表达下降(P<0.05)，见表2。

表2 5组SD大鼠左室心肌组织PI3K和Fas的mRNA表达水平

Table 2.The mRNA expression of PI3K and Fas in left ventri-cular myocardial tissues from the rats in each group (Mean±SD)

GroupnFasmRNAPI3KmRNACON80.32±0.111.07±0.15HFLT90.87±0.13**0.95±0.37HENT140.68±0.25#1.01±0.22HFLT+EPO90.55±0.12##2.92±0.34##HFLT+EPO+LY100.69±0.16△1.59±0.13△

**P<0. 01vsCON;#P<0.05,##P<0.01vsHFLT;△P<0.05vsHFLT+EPO.

5 Western blot检测结果

与HFLT组相比，HFLT+EPO组的EPO处理明显增加大鼠心肌组织中p-Akt和HSP70的水平(P<0.01)，而HFLT+EPO+LY组的LY294002处理则能削弱EPO的上述作用(P<0.05)；CON、HFLT和HFNT组p-Akt和HSP70的表达几乎一样，显示低温和阿霉素处理对p-Akt和HSP70的水平无影响；所有大鼠心肌组织中Akt的水平无显著差异，见图3。

讨 论

最近人们发现气候，尤其是温度能够对心衰患者产生影响，大量研究表明低温能够使心衰患者的住院率及死亡率明显增加，且原因可能是因为低温使心衰患者的心功能恶化， Chang等[4]的研究证实了这一点，以低温刺激心衰大鼠，大鼠的心功能出现进一步下降，而且心力衰竭的过程中常伴随着心肌细胞的凋亡[5]。本研究通过利用阿霉素及气候箱模拟构建低温条件下大鼠心力衰竭模型，证实了低温能够使心衰大鼠心功能明显下降并导致死亡，但对正常大鼠无明显影响。故本研究以低温环境下心衰大鼠作为实验动物模型，寻找低温环境下除传统治疗心衰药物外的新型药物。

Figure 3.The protein levels of HSP70, p-Akt and Akt in left ventricular myocardial tissues from the rats with different treatments. Mean±SD.n=3.##P<0.01vsHFLT;△P<0.05vsHFLT+EPO.

图3 5组SD大鼠左室心肌组织HSP70、p-Akt及Akt蛋白的表达

EPO是一种由肾脏分泌的糖蛋白，能与特异性的促红细胞生成受体结合，刺激红细胞的增殖与分化[6]，早期主要用于治疗慢性贫血，然而近年来研究发现促红细胞生成素不仅能够促进红细胞生成且能够对心肌细胞及心脏功能起保护作用[7]。而van der Meer等[8]进一步证实在大鼠的心脏内存在功能性促红细胞生成素受体，且在大鼠心脏的缺血再灌注期，给予EPO能够显著改善左室功能，减轻心肌组织的损伤。

PI3K/Akt信号通路是近年来发现的体内重要的信号转导通路之一，已经证实它可以介导多种细胞的保护作用，包括心肌细胞。有文献表明Akt活化后可上调HSP70的表达，而热休克蛋白是公认的保护性蛋白，HSP70是其重要成员之一，低温、缺氧等均可诱导其产生并对大鼠心肌细胞起保护作用[9-10]。此外另有研究表明PI3K/Akt在抵抗Fas调节的细胞凋亡中起着主要作用[11]，即PI3K/Akt对心肌细胞起保护作用的机制还可能与其抗心肌细胞凋亡有关，本研究结果提示低温环境下心衰大鼠心肌细胞凋亡数明显增加，射血分数明显降低，说明心衰大鼠的心功能在低温的刺激下进一步下降，进一步的研究表明低温下心衰大鼠心肌细胞中Fas的 mRNA表达明显升高，HSP70及PI3K的mRNA表达则未见明显升高，与Tanonaka等[9]的研究不符，这可能是因为心衰大鼠较正常大鼠对低温刺激的反应性降低所致，由此可见低温不能诱导心衰大鼠心肌细胞中HSP70的升高并对大鼠心肌细胞起保护作用。而经EPO处理后心衰大鼠心肌细胞中HSP70和PI3K的mRNA表达明显升高，Fas的mRNA表达则明显降低，同时心肌细胞凋亡数明显减少，射血分数明显升高，说明心功能得到明显改善，而LY294002则可阻断这一作用。由此可见EPO的心肌细胞保护机制是由PI3K/Akt途径介导的。

综上所述，EPO能改善心衰大鼠的心功能，进一步增强其对低温的耐受力，除治疗贫血外也是一种高效的心脏保护剂。其作用基础可能是通过激活PI3K/Akt途径，增加HSP70的表达、抗心肌凋亡等保护受损的心肌，这其中是否还有其它信号通路的参与，尚需进一步的考证。相信随着对EPO作用及其机制的深入研究，EPO及其衍生物必将成为心脏保护治疗的一种新方法。

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(责任编辑： 林白霜， 罗 森)

Erythropoietin protects rats with heart failure in hypothermia by activating PI3K/Akt pathway and upregulating the expression of HSP70

DENG Qin-qin1, WANG Meng-hong2， PEI Zhao-hui1

(1TheSecondDepartmentofCardiology,NanchangThirdMunicipalHospital,Nanchang330009,China2DepartmentofCardiology,TheFirstAffiliatedHospitalofNanchangUniversity,Nanchang330006,China.E-mail:wmh666888@sina.com)

AIM: To investigate the effect oferythropoietin (EPO) on the rats with heart failure (HF) in hypothermia and to explore its underlying mechanism. METHODS: The Sprague-Dawley rats (n=80) were randomly divided into five groups: control group (CON group), HF in low-temperature group (HFLT group), HF in normal temperature group (HFNT group), HF with EPO in low temperature group (HFLT+EPO group), and HF with EPO and LY2940002 in low temperature group (HFLT+EPO+LY group). All rats were housed in artifitial climate chamber. The animals in CON, HFLT, HFLT+EPO and HFLT+EPO+LY groups were under the low-temperature environment， while those in HFNT group were under normal temperature. The heart function was evaluated by echocardiography. The rats were then executed and the hearts were harvested. The apoptosis of myocytes was assessed by TUNEL method. The mRNA expression of Fas and PI3K was detected by fluorescence quantitative PCR (qPCR) and the protein levels of HSP70, Akt and p-Akt in the myocardial tissues were determined by Western blot. RESULTS: The rat cardiac functions in HFLT group were significantly deteriorated compared with HFNT group. The cardiac functions in HFLT+EPO group were improved compared with HFLT group. The cardiac functions in HFLT+EPO+LY group were significantly pejorated compared with HFLT+EPO group. The apoptotic index of the myocardium in HFLT group and HFNT group was significantly higher than that in CON group (P<0.01). The apoptotic index of the myocardium in HFLT group was significantly higher than that in HFNT group (P<0.05).The apoptotic index of the myocardium in HFLT+EPO group was significantly lower than that in HFLT group (P<0.01).The mRNA expression of Fas in HFLT group was significantly higher than that in HFNT group, and no obvious difference of the mRNA expression level of PI3K between HFLT group and HFNT group was observed. The mRNA expression of PI3K in HFLT+EPO group was significantly lower than that in HFLT group and HFLT+EPO+LY group (P<0.05), and that in HFLT+EPO group was significantly higher than that in HFLT group and HFLT+EPO+LY group (P<0.05). The protein levels of p-Akt and HSP70 in HFLT+EPO group was also higher than those in HFLT group and HFLT+EPO+LY group (P<0.05), and no obvious difference of the protein levels of p-Akt and HSP70 in CON, HFLT and HFNT groups was found. The protein level of Akt had no significant difference in each group. CONCLUSION: The pathway of PI3K/Akt may be one of the cardioprotective ways of EPO. EPO activates the PI3K/Akt pathway， upregulates the experssion of HSP70 (an endogenous protective factor) and inhibits the apoptosis, thus protecting the cardiac functions in the rats with HF in hypothermia.

Erythropoietin; Hypothermia; Heart failure; PI3K/Akt signaling pathway

1000- 4718(2017)07- 1203- 06

2016- 09- 20

2017- 05- 16

国家自然科学基金资助项目(No. 81260293)

R363.1+23； R541.6

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.07.008

杂志网址： http://www.cjpp.net

△通讯作者 Tel： 0791-88692501； E-mail： wmh666888@sina.com