冠通方对兔心肌缺血再灌注损伤心肌细胞凋亡形态学的影响

韦 斌，王 强，姜 浩，朱志华，陈广琴，尹 玮，骆 虹

·基础医学论著/研究·

冠通方对兔心肌缺血再灌注损伤心肌细胞凋亡形态学的影响

韦 斌1，王 强1，姜 浩2，朱志华1，陈广琴1，尹 玮1，骆 虹1

目的 观察冠通方对兔心肌缺血再灌注损伤后心肌细胞凋亡的病理变化，进一步证实冠通方对心肌细胞的保护作用。方法 将48只新西兰大白兔随机分为假手术组、模型对照组、中药对照组、冠通方大剂量组、冠通方中剂量组、冠通方小剂量组，每组各8只。各组分别连续灌胃14 d，制备左室心肌病理切片。比较各组病理切片在光镜下心肌细胞病理形态学结构变化，使用原位末端标记法(TUNEL法)测定各组凋亡细胞指数。结果 冠通方大、中剂量组心肌细胞在光镜下的结构形态得到较好的保护，冠通方大、中剂量组细胞凋亡指数较模型组显著下降(P<0.05)。结论 冠通方可以减轻心肌缺血再灌注心肌细胞的损伤，有效减少心肌缺血再灌注后心肌细胞的凋亡，从而达到保护心肌细胞的作用。

心肌缺血再灌注损伤；冠通方；机制研究

心肌缺血再灌注损伤(myocardial ischemia reperfusion injury，MIRI)是心脏缺血性病变再通后常见的并发症，可导致心肌细胞超微结构、功能、代谢及电生理等方面发生进一步损伤，并可出现严重的心肌细胞内凋亡基因的表达增高或心肌细胞凋亡。冠通方的近期药理研究表明[1]：使用冠通方预处理可使缺血再灌注损伤(IRI)大鼠模型的损伤心肌组织中白细胞介素-8(IL-8)表达下降，白细胞介素-10(IL-10)表达增高，有效抑制炎症机制及坏死机制，起保护心肌的作用。本研究通过后期动物实验观察不同剂量的冠通方干预兔心脏再灌注损伤后心肌细胞的凋亡及病理形态改变，进一步验证了冠通方对心肌细胞的保护作用。

1 材料与方法

1.1 动物 48只新西兰大白兔，购自广西医科大学实验动物中心[生产许可证号SCXK(桂)2011-0003]，体质量2.5 kg～3 kg，适应性饲养1周后开始分组。

1.2 实验药物 冠通方组成：田七45 g，生晒参100 g，丹参150 g，地龙150 g，全瓜蒌150 g，绞股蓝150 g，麦冬150 g，陈皮100 g。由广西中医药大学制药厂按上述配方制成颗粒剂(每包含生药4 g)，分装规格为每包3.5 g。复方丹参滴丸(每粒27 mg)，由天津天士力制药股份有限公司生产(国药准字Z10950111，生产批号101210)。

1.3 实验试剂及仪器 TUNEL检测细胞凋亡试剂盒为德国Roche公司生产，-20 ℃保存，使用前置于4 ℃溶解混合；DAB显色液试剂盒为北京中杉金桥生物有限公司生产，4 ℃保存，使用前置于室温与稀释液以1∶25稀释混合，现配现用；蛋白酶K溶液为北京中杉金桥生物有限公司生产，-20 ℃保存，使用前置于4 ℃以1∶25稀释，现配现用；磷酸盐缓冲液(PBS)为北京中杉金桥生物有限公司生产，粉剂-4 ℃保存，使用前置于37℃与蒸馏水0.01mol/L稀释，pH为7.2～7.4，现配现用；其余甲醛、酒精、二甲苯等均为国药集团化学试剂有限公司生产，室温避光密封保存。全自动脱水机(德国Leica，ASP300S)，石蜡切片机(德国Leica，RM2245)，奥林巴斯显微镜(日本OLYMPUS，BX53)，病理图文摄像头(日本OLYMPUS，DP73)，小动物呼吸机(北京智鼠多宝生物科技有限公司，DW-3000)。

1.4 方法

1.4.1 分组及给药 将48只新西兰大白兔按随机数字表法随机分为6组，分别为假手术组、模型对照组、中药对照组[复方丹参滴丸54 mg/(kg·d)]、冠通方大剂量组[3.6 g/(kg·d)]、冠通方中剂量组[1.8 g/(kg·d)]、冠通方小剂量组[0.9 g/(kg·d)]，每组8只。用药剂量根据人兔临床用药剂量换算公式[2]换算成兔用药量。实验动物行分笼饲养，于每天早上灌胃给药，假手术组和模型对照组予蒸馏水灌胃。各组均连续灌胃14 d，于末次给药1 h后进行标本采集。

1.4.2 模型建立 经耳缘静脉注射戊巴比妥钠30 mg/kg麻醉后，背位固定，四肢皮下连接心电图电极，记录标准Ⅱ导联心电图。颈部正中切开皮肤，钝性分离颈前肌，切开气管，插入Y型气管插管， 连接微型人工呼吸机(潮气量10 mL/kg～15 mL/kg，频率40次/min)。沿胸骨左缘3～4肋间隙开胸，暴露心脏。采用5～0线结扎冠状动脉左前降支(LAD)法制备心肌缺血再灌注模型，为避免实验动物心肌梗死面积过大导致死亡，冠状动脉阻断点应在冠状动脉左前降支向下5 mm～10 mm处选择结扎位点，以心电图出现ST段弓背抬高和结扎线以下心肌组织颜色变暗、局部节段性运动不良为结扎成功。待结扎40 min后剪断手术线实现再灌注，灌注时间为2 h。以缺血区转红并反应性充血、收缩活动逐渐恢复、ST段恢复1/2以上为再灌注成功。假手术组只穿线不结扎，余操作同上。

1.4.3 标本采集及指标检测

1.4.3.1 IRI心肌组织HE染色病理切片 造模实验结束后，处死兔子，剪下心脏，造模实验结束后，处死兔子，剪下心脏，取左心室心肌(包括缺血边缘区、心肌缺血区、冠状动脉结扎区心肌组织)。将标本置于10%中性甲醛液中固定，经全自动脱水机脱水14 h，常规石蜡包埋，石蜡切片厚4 μm，常规脱蜡至水，进行HE染色、封片，镜下观察心肌组织基本病理改变。

1.4.3.2 TUNEL法染色 参考罗氏TUNEL检测细胞凋亡试剂盒说明书进行，用0.3%过氧化氢溶液封闭30 min；20 mg/L蛋白酶K消化膜蛋白及核蛋白；加入TUNEL反应液，37 ℃孵育60 min；加入FITC标记抗体，DAB显色，苏木素复染，脱水透明，封片。

1.4.3.3 心肌细胞凋亡指数测量 在光镜下观察心肌细胞凋亡情况，电镜下呈棕色颗粒者为染色阳性的凋亡心肌细胞。心肌细胞凋亡指数观察：每只兔子观察4张切片，每张切片在高倍镜下(400×)随机观察5个不同视野，每个视野计算凋亡细胞个数和所有细胞个数，以凋亡阳性细胞数/总细胞数的百分比为心肌细胞凋亡指数，取平均值。

2 结 果

2.1 各组心肌组织HE染色病理形态比较 假手术组心肌细胞形态结构完整，细胞排列整齐，无明显病理损伤。MIRI模型组心肌细胞质增多，细胞肿胀明显，细胞排列紊乱、横纹不清，并呈现点片状坏死灶，提示细胞坏死程度严重。冠通方小剂量组可见心肌细胞水肿，排列紊乱，细胞浆增多，有明显的病理损伤。对照组和冠通方大、中剂量组心肌细胞肿胀较轻，心肌细胞偶有坏死，细胞排列有序。详见图1。

假手术组 模型组 中药对照组

冠通方大剂量组 冠通方中剂量组 冠通方小剂量组

2.2 各组心肌细胞凋亡情况比较 光镜下呈棕色的心肌细胞核为凋亡的阳性细胞，呈蓝色则为非凋亡的阴性细胞。本研究结果表明：冠通方大、中剂量组凋亡细胞数较模型组显著减少。详见图2。各组心肌细胞凋亡指数比较见表1。

假手术组 模型组 中药阳性对照组

冠通方大剂量组 冠通方中剂量组 通方小剂量组

组别n凋亡指数假手术组80.91±0.32模型组828.13±7.62 中药对照组812.83±4.611)冠通方大剂量组813.02±5.831)冠通方中剂量组816.37±5.281)冠通方小剂量组821.22±6.14 与模型组比较,1)P<0.01。

3 讨 论

细胞凋亡是细胞死亡的一种形式，其参与缺血再灌注损伤的病理过程，是缺血再灌注损伤引起心肌细胞死亡的主要原因，成为缺血再灌注损伤影响组织心脏功能的重要途径和表现形式。已有许多研究表明，MIRI与细胞凋亡密切相关[3-5]。因此，减少心肌细胞凋亡是减少缺血再灌注心肌损伤的有效途径。

MIRI中医病机包括气虚、血瘀、痰饮不同的病理过程。谢连娣等[6]指出，气虚导致血瘀和痰饮的形成，血瘀和痰饮导致气虚程度进一步加重。急性心肌梗死时血液供应骤然停止，失去了血液的濡养和运载；急性心肌梗死时，血栓堵塞血液的正常运行，邪正交争，正气损伤；再灌注时突然过多的血液等待运送到组织远端，增加心脏的负担，均导致气虚的形成。心气虚无力推动血液运行，造成微血管栓塞，形成“血瘀”。气虚血瘀可以导致水液代谢受到影响，水液留聚，形成“痰饮”。 多数学者亦认为缺血再灌注损伤的过程涉及气虚、血瘀、痰饮、痰瘀化热化毒；以气虚为本，血瘀痰饮为标。

冠通方方中田七善于活血化瘀，消肿止痛，其化瘀血而不伤新血；丹参性寒凉血，又善活血化瘀，清瘀热，消痈肿，除烦安神；地龙咸寒，善于活血祛瘀通络，同时又能清热化痰；瓜蒌甘寒微苦，善于清热化痰，理气宽胸，消肿散结，同时又具有润肠通便，泻腑安脏之功；生晒参善于大补元气，同时又有生津之功；绞股蓝甘苦性寒具有益气养阴，消热解毒，清热祛痰之功；麦冬甘苦微寒，清热养阴生津；陈皮辛散温通，善于行气燥湿化痰。诸药合用则具有益气养阴，清热解毒化痰，行气活血化瘀通络之功[7]。田七又名三七，主产于云南、广西等地。现代基础研究表明：三七中含有三七总皂苷(PNS)，三七的主要成分是三七总皂苷，已经有报道关于PNS有良好的抗氧化作用[8]，并能抵抗自由基对心肌缺血再灌注后导致的心肌细胞损伤。此外，三七皂苷可抑制脂质过氧化反应，减轻心肌细胞的受损情况，增强抗氧化效果，并具有抑制血小板聚集，促进纤维蛋白溶酶的活性，降低血液黏度，促进血栓溶解，改善血液流动的作用。顾国嵘等[9]通过酶学、形态学、免疫组织化学等研究表明，PNS缺血预处理24 h后能明显减少缺血-再灌注导致的心肌细胞坏死和凋亡，对缺血-再灌注心肌起到延迟保护作用，证明三七治疗缺血性心脏病的基础。PNS能扩张冠脉，增加心肌营养血流量，改善心肌微循环，明显降低心肌耗氧量。同时PNS的抗脂质过氧化作用也是其保护缺血-再灌注心肌的重要方面。丹参的抗氧化成分有丹参酮类、丹参素、丹酚酸类化合物、原儿茶醛、咖啡酸及迷迭香酸，有研究指出[10-11]，丹参酮ⅡA可抑制细胞膜上的NADH/NADPH氧化酶的激活，提高超氧化物歧化酶(SOD)的活性，清除氧自由基并抑制脂质过氧化反应，发挥保护血管内皮细胞的作用。研究表明[12]丹参冻干粉对经皮冠状动脉介入治疗(PCI)后MIRI有保护作用，其可能的机制是抑制炎症反应，改善内皮功能。

本研究通过冠通方对兔MIRI心肌细胞凋亡研究时发现，冠通方可有效发挥心肌细胞保护作用，使MIRI细胞凋亡趋势下降、减少心肌病理损伤，为心肌细胞后期修复打好了坚实的基础。冠通方对MIRI损伤心肌的保护作用是多机制、多靶点、综合作用，因此冠通方对心肌细胞的保护机制依然需要后续探索研究。

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(本文编辑郭怀印)

The Influence of Guantong Decoction on Pathologic Morphology and Myocardial-Cell Apoptotic Index in Rabbits with Myocardial Ischemia Reperfusion Injury

Wei Bin，Wang Qiang，Jiang Hao，Zhu Zhihua，Chen Guangqin，Yin Wei，Luo Hong

Ruikang Hospital，Guangxi University of Traditional Chinese Medicine，Nanning 530011，Guangxi，ChinaCorresponding Author:Wang Qiang

Objective To observe the effect of Guantong decoction(GTD) on pathologic morpho logy in rabbits with myocardial ischemia reperfusion injury .Methods Forty-eight New Zealand white rabbits were randomly divided into 6 groups，namely sham group，normal control group，GTD high dose group，GTD moderate dose group，GTD low dose group and drug control group.The rabbits were taken medicine for 14 days with designated drugs.GTG groups were taken different dose medicine of GTD，and sham operation group and normal control group were pretreated by distilled water.The model of myocardial ischemia-reperfusion injury were established by ligating the left anterior descending artery of New Zealand rabbits for forty minutes after taken medicine for one hour and no coronary artery injury were in sham group.The heart were made into pathological sections and stained with HE and TUNEL.Apoptotic index was detected with electron microscope in times of four hundreds.Results Myocardial injury cells and apoptotic index of GTD high dose group and moderate dose group were less than normal control group and GTD small dose group (P<0.05).Conclusion GTD can effectively protect myocardial cell in rabbits with myocardial ischemia reperfusion injury.

myocardial ischemia reperfusion injury；Guantong decoction；mechanism research

国家自然科学基金项目(No.81160436)

1. 广西中医药大学附属瑞康医院(南宁530011)；2.广西中医药大学第一附属医院

王强，E-mail: wq7212@163.com

信息：韦斌，王强，姜浩，等.冠通方对兔心肌缺血再灌注损伤心肌细胞凋亡形态学的影响[J].中西医结合心脑血管病杂志，2017，15(13)：1569-1572.

R542.2 R285.5

A

10.3969/j.issn.1672-1349.2017.13.008

1672-1349(2017)13-1569-04

2017-02-16)