Rs4129009基因多态性与慢性HBV感染的相关性研究

汤永志 陈巧玲 江挺 朱敏 燕飞 陈华忠 朱坚胜

Rs4129009基因多态性与慢性HBV感染的相关性研究

汤永志 陈巧玲 江挺 朱敏 燕飞 陈华忠 朱坚胜

目的探讨Toll样受体10（TLR10）基因多态性位点Rs4129009（Ile775Val）与慢性HBV感染的关系。方法采集428例慢性HBV感染患者、210例健康对照人群外周血并提取全基因组DNA。采用聚合酶链反应（PCR）法扩增特定基因多态性位点，产物经纯化后直接测序分析。结果两组均符合Hardy-Weinberg平衡（均P＞0.05），即研究对象具有群体代表性。与健康对照组比较，HBV感染组变异型（AG+GG）、等位基因G频率均较低（均P＜0.01）。高病毒载量（＞106IU/ml）、HBeAg阳性的变异型基因比例较高（均P＜0.01），而HBV感染程度、乙肝家族史与基因多态性无关（均P＞0.05）。结论TLR10基因Rs4129009可能与慢性HBV感染相关。

Toll样受体10基因多态性乙型肝炎病毒

慢性HBV感染严重威胁人类健康，每年约有100万人死于HBV感染所致的肝衰竭、肝硬化和肝细胞癌等[1]。Toll样受体2（TLR2）与慢性HBV感染关系密切，TLR2及其信号通路可作为抑制HBV复制的途径，也可成为HBV发生免疫逃避的作用靶点[2]。TLR10是一类缺乏特异性配体的孤儿受体，已有文献报道TLR10基因多态性Rs4129009（Ile775Val）与前列腺癌[3-4]、哮喘[5]、自身免疫性甲状腺疾病[6]等的发生风险存在关联。TLR10基因多态性Rs4129009位点在肝硬化失代偿期合并感染后急性加重，或在慢加急性肝衰竭中促进炎症因子应答，最终降低生存率[7]。TLR10与TLR2异源化形成二聚体或竞争获取IL-1受体激动剂，从而负性调节TLR2下游产生IL-1[8]。然而，TLR10基因多态性与慢性HBV感染是否相关未见报道；故笔者就TLR10外显子区Rs4129009（Ile775Val）多态性与慢性HBV感染的关系作一探讨，现报道如下。

1 对象和方法

1.1 对象选择2012年9月至2015年12月在温州医科大学附属台州医院因慢性乙型肝炎活动首次住院的428例患者为HBV感染组，其中男280例，女148例；年龄18～73（41.8±11.8）岁；所有患者符合2010年《慢性乙型肝炎防治指南》的诊断标准，并排除其他类型病毒肝炎、自身免疫性疾病、感染、药物、饮酒等引起肝功能异常。选择同期在该院体检中心健康体检的210例健康者为健康对照组，其中男134例，女76例；年龄22～69（42.0±10.1）岁；排除糖尿病、脂肪肝、自身免疫性疾病等体检异常。两组研究对象均为浙江地区汉族人，年龄、性别比较差异均无统计学意义（均P＞0.05）。本研究通过医院伦理委员会批准。

1.2 试剂和设备血液基因组DNA提取试剂盒（1408G26，上海捷瑞生物工程有限公司）；PCR引物（F：141124B85/R：141124B86，上海捷瑞生物工程有限公司）。核酸定量分析仪（1702525，美国Bio-rad公司）；小型高速离心机（5418，德国Eppendorf公司）；DNA测序仪（3730XL，美国ABI公司）。

1.3 方法

1.3.1 标本采集清晨采集研究对象的空腹静脉血2～3ml；血液标本管含EDTA-Na抗凝，用于外周血基因组DNA提取；置于-80℃保存备用。

1.3.2 TLR10外显子区Rs4129009基因多态性检测（1）DNA提取：使用血液基因组DNA抽提试剂盒提取全血基因组DNA，采用核酸定量分析仪检测DNA浓度及A260/A280比值，比值在1.7～2.0之间的样本作为PCR扩增模板。（2）PCR扩增TLR10外显子区上游引物：5′-CCAACTTTGTCCAGAATGAGTG-3′；下游引物5′-AGTGTATGTGGTCCCCAACTTC-3′。PCR扩增体系：10×缓冲液2.5μl，DNA模板0.5μl，MgCl21.0μl（25mmol/L），dNTP 0.5μl，TaqDNA聚合酶0.25μl，引物各0.5μl，总体积为25μl，剩余体积用双蒸水补足。PCR反应条件：95℃预变性2min，94℃变性45s，56℃退火90s，72℃延伸2min；共循环35次；吸取扩增产物5μl，加入溴化乙锭染色的1.5%琼脂糖凝胶中电泳，凝胶成像分析PCR产物特异性。（3）DNA测序：PCR扩增产物采用ABI3730XL测序仪进行基因序列分析，由上海桑尼生物科技有限公司完成。

1.4 统计学处理应用SPSS 17.0统计软件。两组Rs4129009错义突变位点进行Hardy-Weinberg平衡检验，以验证其群体代表性。两组基因型及等位基因频率[等位基因频率=（纯合子数×2+杂合子数）/（受检人群×2）]比较采用χ2检验。两组年龄比较采用独立样本t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 扩增测序结果HBV感染组与健康对照组PCR产物及基因测序PCR扩增产物长度为383bp，扩增片段测序结果见图1。

图1 TLR10基因Rs4129009位点的序列图谱（a：野生纯合子AA；b：变异纯合子GG；c：变异杂合子AG）

2.2 两组基因型及等位基因频率比较经检验，两组均符合Hardy-Weinberg平衡（χ2=1.12、3.02，均P＞0.05），表明研究对象具有群体代表性。HBV感染组AG+GG（变异型）频率为44.2%（189/428），低于健康对照组的60.5%（127/210），差异有统计学意义（P＜0.01）；HBV感染组等位基因G频率为25.9%（222/856），明显低于健康对照组的35.0%（147/420），差异有统计学意义（P＜0.01），见表2。

表2 Rs4129009基因型及等位基因的分布特征（个）

2.3 HBV感染临床特征与基因多态性的关系根据2000年中华医学会传染病与寄生虫病学会和肝病学会修订的《病毒性肝炎防治方案》将慢性HBV感染分为轻度、中度和重度，经检验发现不同HBV感染程度的基因多态性比较差异无统计学意义（P＞0.05）；根据HBV DNA载量分成＜103IU/ml、103～106IU/ml、＞106IU/ml，经检验发现＞106IU/ml组变异型比例较高（P＜0.01），提示携带高病毒载量人群的变异型比例较高；此外，HBeAg阳性患者变异型比例较高（P＜0.01），乙肝家族史与基因多态性无关（P＞0.05），见表3。

表3 HBV感染临床特征与基因多态性的关系（例）

3 讨论

TLR是哺乳动物和昆虫体内一类进化保守的I型跨膜蛋白，广泛分布于多种细胞，能识别特定微生物表面的分子结构——病原微生物相关分子模式（PAMPs），参与机体固有免疫和适应性免疫应答。人类TLR是一类高度保守的Toll样蛋白，与果蝇的Toll样蛋白同源，目前已确定有10种TLR在人类细胞上表达[9-10]。Wieland等[11]报道TLR3配体诱导产生IFN-β并抑制HBV复制；但在慢性HBV感染患者中TLR3表达及分泌功能受损[12]，经抗病毒治疗后可恢复；抗病毒应答不佳或复发时，TLR3表达再次下降。TLR2与TLR4拥有共同的MyD88信号通路，其下游分泌的IL-6、TNF-α能抑制原代肝细胞中HBV的复制[13-14]；而相较于HBeAg阴性患者和健康人群，HBeAg阳性患者在肝细胞、库弗细胞和外周单个核细胞中TLR2表达水平明显下调[15]。HBV也可降低TLR2表达或抑制其信号通路以逃避免疫应答，且TLR2表达与肝脏炎症坏死成正比，在中重度肝炎、肝硬化和肝衰竭中可检测到TLR2表达明显增加，提示TLR2在肝炎和肝硬化的发生、发展中也起着重要作用[2]。TLR10位于4号染色体短臂1区3带，包含4个外显子，与TLR2、TLR1、TLR6形成基因簇，具体生物学功能尚未完全阐明，TLR10的配体至今未被确定，且缺乏经典的下游信号通路[16]，是TLR家族中的一类孤儿受体。TLR2与TLR1、TLR6形成同源或异源二聚体，参与针对大量细菌、真菌、病毒等病原微生物的免疫应答，系统进化树分析表明TLR10与TLR2密切相关；提示TLR10需要TLR2协助形成二聚体，从而募集MyD88，影响下游炎症因子分泌以参与固有免疫应答[16-17]。进一步研究显示TLR10和TLR2同时表达的细胞系信号转导通路下游IL-8分泌下降，特异性抗人TLR10抗体阻断TLR10后TLR2下游IL-1分泌上调，提示TLR10为一负性调节受体[8]，且TLR10对依赖MyD88、TRIF、MA-PK、IκB的信号通路及独立的TLR通路也具有广泛抑制效应[18]。

TLR10基因单核苷酸多态性与人类疾病关系密切。一项多态性研究报道TLR10的2个SNPs位点（Rs11096955、Rs11096957）及TLR1基因上的多个SNPs位点均与前列腺癌发生密切相关[4]。亦有研究表明TLR10单核苷酸多态性位点Rs4129009（c.2322A＞G）变异与哮喘发作风险相关[5]。另有报道EB病毒感染相关鼻咽癌、IgA肾病与TLR10的基因多态性位点也有一定关联[19-20]。

Rs4129009是TLR10外显子基因序列上的单核苷酸突变位点（G/A/T/C），不同碱基配对可导致蛋白表达改变；目前有研究表明Rs4129009（Ile775Val）基因多态性与前列腺癌[3-4]、哮喘[5]、自身免疫性甲状腺疾病[6]等的发生风险存在关联。为明确HBV感染与Rs4129009位点是否相关，本研究比较并分析428例慢性HBV感染患者与210例健康人群的基因型，结果显示HBV感染组AG+GG基因型频率、G等位基因频率与健康对照组比较，差异均有统计学意义；高病毒载量、HBeAg阳性的基因变异型比例较高，但与HBV感染程度、乙肝家族史均无关。

综上所述，TLR2与慢性HBV感染关系密切，TLR2及其信号通路可作为抑制HBV复制的途径，但也可成为HBV发生免疫逃避的作用靶点[2]。TLR10对TLR2信号通路下游的炎症因子具有负性调节作用，有利于HBV发生免疫逃逸。本研究结果提示Rs4129009与HBV感染相关，但与HBV感染程度无关；基因变异后易出现高病毒载量、HBeAg阳性。但是，TLR10的负性调节是否通过上述基因介导的信号通路参与TLR2对HBV感染的调控而最终导致HBV慢性感染，尚需进一步研究。

[1]Lavanchy D.Hepatitis B virus epidemiology,disease burden, treatment,and current and emerging prevention and control measures[J].Journalof viralhepatitis,2004,11(2):97-107.

[2]Bagheri V,Askari A,Arababadi M K,et al.Can toll-like receptor(TLR)2 be considered as a new target for immunotherapy against hepatitis B infection?[J].Human immunology,2014,75(6): 549-554.

[3]Sun J,Wiklund F,Zheng S L,et al.Sequence variants in toll-like receptor gene cluster(TLR6-TLR1-TLR10)and prostate cancer risk[J].Journal of the National Cancer Institute,2005,97(7): 525-532.

[4]Stevens VL,Hsing A W,Talbot J T,et al.Genetic variation in the toll-like receptor gene cluster(TLR10-TLR1-TLR6)and prostate cancer risk[J].International journal of cancer Journal international du cancer,2008,123(11):2644-2650.

[5]Kormann M S,Depner M,Hartl L D,et al.Toll-like receptor heterodimer variants protect from childhood asthma[J].The Journal of allergy and clinical immunology,2008,122(1):86-92, e1-8.

[6]Cho W K,Jang J P,Choi E J,et al.Association of toll-like receptor 10 polymorphisms with autoimmune thyroid disease in Korean children[J].Thyroid official journal of the American Thyroid Association,2014,25(2):250-255.

[7]Domenicali M,Caraceni P,Baldassarre M,et al.The TLR10 polymorphism rs4129009 is associated to poor 28-day survivalin patientswithcirrhosisandacuteonchronicliverfailure precipitated by bacterialinfection[J].Digestive and Liver Disease, 2016,48(Suppl1):e16.

[8]Oosting M,Cheng S C,Bolscher J M,et al.Human TLR10 is an anti-inflammatory pattern-recognition receptor[J].Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America,2014,111(42):E4478-4484.

[9]Medzhitov R,Preston-hurlburt P,Janeway C A.A human homologue of the Drosophila Tollprotein signals activation of adaptive immunity[J].Nature,1997,388(6640):394-397.

[10]Lemaitre B,Nicolas E,Michaut L,et al.Pillars article:the dorsoventral regulatory gene cassette spatzle/toll/cactus controls the potent antifungal response in Drosophila adults[J]. Journalof immunology,2012,188(11):5210-5220.

[11]Wieland S F,Guidotti L G,Chisari F V.Intrahepatic induction of alpha/beta interferon eliminates viralRNA-containing capsids in hepatitis B virus transgenic mice[J].Journal of virology,2000, 74(9):4165-4173.

[12]Huang YW,Lin S C,WeiS C,et al.Reduced Toll-like receptor 3 expression in chronic hepatitis B patients and its restoration by interferon therapy[J].Antiviraltherapy,2013,18(7):877-884.

[13]Hosel M,Quasdorff M,Wiegmann K,et al.Not interferon,but interleukin-6 controls early gene expression in hepatitis B virus infection[J].Hepatology,2009,50(6):1773-1782.

[14]Xu Y,Kock J,Lu Y,et al.Suppression of hepatitis B virus replication in Tupaia hepatocytes by tumor necrosis factor alpha of Tupaia belangeri[J].Comparative immunology,microbiology and infectious diseases,2011,34(4):361-368.

[15]Visvanathan K,Skinner N A,Thompson A J,et al.Regulation of toll-like receptor-2 expression in chronic hepatitis B by the precore protein[J].Hepatology,2007,45(1):102-110.

[16]Guan Y,Ranoa D R,Jiang S,et al.Human TLRs 10 and 1 share commonmechanismsof innateimmunesensingbut not signaling[J].Journalof immunology,2010,184(9):5094-5103.

[17]Zhou H,Gu J,Lamont S J,et al.Evolutionary analysis for functional divergence of the toll-like receptor gene family and altered functional constraints[J].Journal of molecular evolution, 2007,65(2):119-123.

[18]Jiang S,Li X,Hess N J,et al.TLR10 is a negative regulator of both MyD88-dependent and-independent TLR signaling[J]. Journalof immunology,2016,196(9):3834-3841.

[19]Zhou XX,Jia WH,Shen G P,et al.Sequence variants in toll-like receptor 10 are associated with nasopharyngeal carcinoma risk [J].Cancer epidemiology,biomarkers&prevention,2006,15(5): 862-866.

[20]Park H J,Hahn W H,Suh J S,et al.Association between toll-like receptor 10(TLR10)gene polymorphisms and childhood IgA nephropathy[J].European journal of pediatrics,2011,170(4): 503-509.

Association of TLR10 Rs4129009 gene polymorphism with chronic hepatitis B virus infection

TANG Yongzhi,CHEN Qiaoling, JIANG Ting,et al.Department of Infectious Diseases,Taizhou Hospital Affiliated to Wenzhou Medical University,Taizhou 317000, China

ObjectiveTo investigate the relationship between the gene polymorphism of Toll like receptor 10(TLR10)and chronic HBVinfection.MethodsThe peripheral blood samples from 428 chronic HBVinfected patients and 210 healthy controls were collected.The extracted whole genome DNA was specifically amplified by polymerase chain reaction(PCR).Then,direct sequencing was performed.ResultsThe characteristics of two groups were in accordence with Hardy-Weinberg balance (both P＞0.05).The frequency of AG+GG genotypes and G allele in HBVinfected group were lower than those in healthy control (P＜0.01).The subgroup analysis demonstrated that variant gene in HBVDNA＞106IU/ml group and HBeAg positive group were higher than the other groups(P＜0.01),nevertheless,no significant difference were found in the subgroups of the severity of HBV infection and family medical history(P＞0.05).ConclusionPolimorphism of Rs4129009 in TLR10 may be related to chronic HBV infection.

Toll like receptor 10PolymorphismHepatitis B virus

2016-08-25）

（本文编辑：陈丹）

10.12056/j.issn.1006-2785.2017.39.13.2016-1352

台州市科技计划项目（20111ky0604）

317000温州医科大学附属台州医院感染科（汤永志、陈巧玲、燕飞、陈华忠、朱坚胜），科教部（朱敏）；临海市第一人民医院感染科（江挺）

朱坚胜，E-mail：zhujs@enzemed.com