葛瑞林对慢性心力衰竭大鼠心肌组织及血液中TRX和ASK1表达的影响

徐建博 张茹冰 陈颖 陈哲 刘隽东 陈振栋

葛瑞林对慢性心力衰竭大鼠心肌组织及血液中TRX和ASK1表达的影响

徐建博 张茹冰 陈颖 陈哲 刘隽东 陈振栋

目的探讨葛瑞林（Ghrelin）对慢性心力衰竭（CHF）大鼠心肌组织及血液中硫氧还蛋（TRX）和凋亡信号调节激酶1（ASK1）表达的影响。方法选择SD雄性大鼠60只，采用结扎左冠状动脉前降支建立大鼠CHF模型，按随机数字表法分为对照组和观察组，各30只。观察组给予尾静脉注射Ghrelin，对照组给予尾静脉注射0.9%氯化钠溶液。在第2、20、45天时，光镜和电镜观察各组大鼠心肌组织形态学及心肌细胞超微结构情况。第45天时，多道生理仪检测左心室功能的变化情况；免疫组化法检测TRX及pASK1表达水平；RT-PCR检测TRX及ASK1mRNA表达水平。结果HE染色在第2、20、45天时，对照组心肌细胞损伤均比观察组明显。第45天时，对照组心肌细胞超微结构损伤比观察组更明显；观察组左心室射血分数（EF）和左心室短轴缩短率（FS）较对照组高（均P＜0.05）；观察组ASK1免疫组化面积比和ASK1 mRNA表达水平均低于对照组，TRX免疫组化面积比和TRXmRNA表达水平明显高于对照组（均P＜0.01）。结论Ghrelin可下调CHF心肌组织中ASK1的表达，上调TRX表达，从而改善CHF心脏生物学功能。

心力衰竭心肌病理学心肌细胞细胞凋亡

慢性心力衰竭（CHF）是临床中常见的心血管疾病，是心血管病的最终归宿[1]。数据显示，我国CHF的患病率约为0.9%，且女性多于男性，临床上对CHF难以逆转治疗。随着CHF被作为医学界重点研究的课题，目前CHF的治疗途径已有本质转变[2]。凋亡信号调节激酶1（ASK1）是近来研究比较热门的一种细胞转导通路上启动细胞凋亡的关键蛋白，它在机体功能作用上起到非常重要的作用。心肌组织中硫氧还蛋（TRX）具有抗凋亡、抗氧化、抗炎、保护再灌注损伤等作用。葛瑞林（Ghrelin）是从胃黏膜分离纯化的多肽生长激素促分泌受体（GHSR）释放肽，研究证明Ghrelin具有明显的心血管保护作用[3]。Ghrelin可上调TRX及下调ASK1的表达，达到改善心功能作用。本研究通过对CHF大鼠进行Ghrelin干预治疗，旨在为CHF的预防和治疗提供理论依据，现报道如下。

1 材料和方法

1.1 材料健康成年SD大鼠（体重250g左右）60只，由北京华阜康生物科技股份有限公司提供，每笼饲养5～6只，自由摄食及饮水，饲养环境温度20℃左右，相对湿度50%左右，光照明暗时间比为1∶1。主要实验仪器及试剂：TGL-10K离心机（上海圣科仪器设备有限公司）、RM2265切片机（德国LEICA公司）、FA2204C电子天平（常州杰博森仪器有限公司）、UV-2000紫外分析仪（上海科学仪器厂生产）、DYCZ-20A电泳槽（北京市六一仪器厂制造）、JEM-1400透射电子显微镜（日本电子公司），Ghrelin[吉尔生化（上海）有限公司，批号：20140307，规格：5mg]、D-Lys3-GHRP-6（美国Cell Signaling公司，批号：150509NOP，规格：5mg）、ASK1（美国Cell Signaling公司，批号：20140907，规格：96T）、TRX（美国Cell Signaling公司，批号：20140313，规格：96T），引物由上海博亚生物技术有限公司提供。

1.2 方法

1.2.1 模型制备及分组采用结扎大鼠冠状动脉前降支建立大鼠CHF模型，所有大鼠禁食12h，禁水6h后，按照3.0ml/kg标准进行10%水合氯醛腹腔注射，麻醉后通过手术将心脏轻挤出，用0号无损伤线结扎大鼠的左前降支，从左向右进针（深度0.3cm，宽度0.2cm），快速缝扎小束心肌，观测搏动减弱、左心室前壁部分颜色变浅，则模型建立成功，术后给予大鼠青霉素预防感染及保温，完全苏醒后送回鼠笼饲养。采用随机数字表法分为观察组和对照组，各30只，术后12h，对照组尾静脉注射0.9%氯化钠溶液[25μg/（kg·d）]，观察组尾静脉注射Ghrelin[25μg/（kg.d）]，给药周期：模型制备成功后第2～45天。

1.2.2 组织形态学观察分别在第2、20、45天时，每组取大鼠10只，麻醉（10%水合氯醛）后开胸，在左心房注射5ml 10%氯化钾，取出心脏并固定（4%多聚甲醛）24～ 48h，切片（厚度：2～3mm）后制作成石蜡，4℃备存。将厚度3μm的切片经HE染色后光镜观察。取大鼠心肌组织作为标本，切成长条（1mm×1mm×2mm），2.5%戊二醛和1 %的四氧化锇进行固定，梯度丙酮脱水进行树脂包埋，将超薄切片（60nm）采用柠檬酸铅和醋酸双氧铀双重电子染色15min，采用透射电镜（加速电压：60～80kV，放大倍数：6 000～20 000倍），观察其心肌组织的超微结构。1.2.3心肌组织中TRX和ASK1表达检测

1.2.3.1采用免疫组织化学方法观测心肌中TRX和ASK1的表达将石蜡包埋组织切片（厚度3μm），常规脱蜡后，加入3%过氧化氢溶液50μl，在恒温箱（20℃）孵育10min，对内源性过氧化物酶的活性进阻断，PBS冲洗3次，加入50μl的一抗，4℃下过夜后，加入二抗，20℃下孵育15min，取DBA试剂盒中的A、B、C试剂加至切片显色，放入显微镜下观察，显色后用纯净水洗掉，终止显色，苏木素复染，中性树胶封片。以免疫组化阳性染色面积比来表示TRX及ASK1的表达水平。

1.2.3.2采用RT-PCR技术检测心肌组织中TRX和ASK1 mRNA的表达（1）取各组大鼠心肌组织100mg，放置在-70℃冰箱备存；（2）严格按照Trizol试剂说明书提取心肌组织总RNA；（3）采用Access RT-PCR系统将组织总RNA扩增成DNA目的片段；（4）PCR产物经EB染色和2%琼脂糖凝胶电泳后，采用紫外分析仪进行观察，并采用HMIAS-2000高清晰度彩色医学图文分析系统进行定量分析，用TRX和ASK1 mRNA与GAPDH的灰度比值表示TRX和ASK1 mRNA的相对表达水平。

1.2.4 多道生理仪检测左心室功能的变化情况第45天时测两组左心室射血分数（LVEF）与左心室短轴缩短率（LVFS）。

1.3 统计学处理采用SPSS 19.0统计软件，测得计量资料以表示，两组间比较采用t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组组织形态学比较光镜观察显示，第2、20、45天时，对照组心肌结构破坏比观察组严重，梗死部位心肌组织比观察组变的更薄，毛细血管比观察组减少明显；电镜观察结果显示，第45天时对照组心肌纤维断裂比观察组重，心肌纤维化比观察组更明显（图1）。

2.2 两组LVEF和LVFS比较第45天时，观察组LVEF和LVFS分别为（48.93±1.15）%、（26.54±1.04）%，对照组LVEF和LVFS分别为（36.72±1.27）%、（18.64± 1.12）%，观察组均明显高于对照组（均P＜0.05），见图2。

图1 两组组织形态学比较（a、c、e分别为第2、20、45天时光镜下对照组心肌组织形态学，b、d、f分别为第2、20、45天时光镜下观察组组心肌组织形态学；g为电镜下第45天时对照组心肌组织超微结构情况，h为观察组心肌组织超微结构情况）

图2 第45天时两组大鼠LVEF和LVFS比较

2.3 第45天时两组大鼠TRX和ASK1表达情况比较见表1、图3。

表1 第45天时两组大鼠的TRX和ASK1表达比较

由表1、图3可见，观察组ASK1免疫组化面积比和ASK1 mRNA相对表达量均低于对照组，TRX免疫组化面积比和TRX mRNA明显高于对照组（均P＜0.01）。

图3 第45天时两组大鼠TRX和ASK1表达情况（a为观察组ASK1免疫组化情况，b为对照组ASK1免疫组化情况，c为观察组TRX免疫组化情况，d为对照组TRX免疫组化情况）

3 讨论

随着我国社会老龄化程度不断加剧，CHF的发病率也随之不断增长。CHF是临床上一种常见的复杂性综合征，具有很高的病死率，患者5年生存率与癌症相接近[4]。CHF诱发原因较多，可包括感染、体力劳动过重、心律失常、情绪激动、输血或输液过快过量、严重贫血、大出血等原因从而使心脏负荷加重，心脏舒缩功能发生异常，出现血管舒缩功能异常和循环血量障碍[5]。CHF的主要病理机制为内分泌和神经系统被激活，导致心室重构。很多研究显示，心内的神经-内分泌-免疫调节网络系统通过严密精细的调节机制，使各种细胞因子、神经递质、激素及神经肽等信息分子相互刺激和制约，从而达到系统内部相对稳定及自我调节[6]。在CHF发生及发展过程中，诸多诱因会使心肌受损，并使三大系统之间稳定性遭到继发性破坏，导致细胞凋亡及心室重构，形成不可逆的恶性循环。目前CHF的生物学治疗已成为热门的研究课题。

ASK1是有丝分裂原激活蛋白激酶的上游激酶，是细胞丝裂原活化蛋白激酶激酶激酶（MAPKKK）家族成员之一[7]。ASK1在正常的细胞中会受多种蛋白调控，通常为无活性状态，当机体发生病理变化时，ASK1结合蛋白发生系列改变，从而ASK1被激活，并对炎性细胞因子及应激刺激作出应答，进而激活SEKI-JNK及MKK3/MKK6-p38，发生信号级联反应，成为细胞凋亡的关键因素[8]。相关研究发现，ASK1会参与心肌细胞的存活、生长、增殖、分化、炎症反应及凋亡，通过激活JNK（ASK1-MKK4/MKK7-JNK）和p38（ASK1-MKK3/ MKK6-P38MAPK），并通过凋亡途径进而诱导CHF的发生与发展。

TRX系统主要包括TRX、TRX还原酶（TRXR）及还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH），是一种对抗氧化应激的二硫还原酶系统[9]。TRX系统对细胞存活及功能而言不可或缺，并在细胞死亡、病毒感染及免疫应答中发挥关键性作用。TRX是细胞内一种具有多种生物学功能的主要抗氧化剂，且分布广泛[10]。TRX可通过参与机体氧化还原反应，对细胞的生存和增殖产生影响，并对多种转录因子的活性进行调节，参与心肌组织的应激反应，在CHF的病理生理过程中起到重要作用。TRX与ASK1关系密切，是调控ASK1的关键调节因子，是ASK1的内源性抑制剂，机体正常时，两者会紧密结合，当受到炎性细胞因子及应激刺激时，两者的结合发生松动，从而使ASK1被分离激活。相关研究发现，TRX可降解ASK1，并对ASK1的活性化产生抑制[11]。

上世纪90年代在胃组织中成功提取出Ghrelin，它可刺激机体的食欲，增加摄食量，进而影响脂肪和能量代谢，并会剂量依赖性调节胃酸分泌和胃肠蠕动；Ghrelin可增强机体的免疫及抗炎能力[12]。本研究结果显示，第45天时，观察组LVEF和LVFS明显高于对照组（P＜0.05），这是因为Ghrelin会对血管产生扩张作用，从而减轻后负荷，改善心脏泵血功能，增加LVEF和LVFS，并对心肌细胞起到保护作用，从而改善心脏功能。本研究结果显示，在第2、20、45天时，通过光镜可观察到对照组心肌细胞损伤均比观察组更明显；且电镜发现对照组心肌细胞超微结构损伤要比观察组更明显，这可能是因为注射Ghrelin后会维持机体代谢平衡，CHF大鼠的平均动脉压可受到Ghrelin调节，并能使平均动脉压降低；Ghrelin可有效抗细胞增殖，可代偿性地抑制平滑肌细胞的增生及迁移，减轻心肌损伤并改善心肌萎缩，从而减缓CHF的进展。本研究结果发现，第45天时，两组大鼠TRX和ASK1表达情况，观察组ASK1免疫组化面积比和ASK1 mRNA相对表达量均低于对照组，TRX免疫组化面积比和TRX mRNA明显高于对照组（P＜0.05），这可能因为Ghrelin具有抗炎作用，与抑制IL-8、氧化应激及细胞因子的产生有关；有研究发现，血清活性Ghrelin的水平与氧化应激呈负相关，Ghrelin可间接加固TRX与ASK1的结合，同时促进TRX的释放效应，从而降低ASK1的活化。

综上所述，Ghrelin对CHF大鼠心脏功能不全或损伤均具有改善作用，可上调肌组织中TRX并降低ASK1表达，为临床CHF的治疗提供理论依据。

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Effect of Ghrelin on expression of TRX and ASK1 in myocardium and blood of chronic heart failure rats

XU Jianbo,ZHANG Rubing, CHENYing,et al.Department of Critical Care Medicine,First Affiliated Hospital of Jiamusi University,Jiamusi 154002,China

ObjectiveTo investigate the effect of Ghrelin on the expression of thioredoxin(TRX)and apoptotic signal kinase 1(ASK1)in myocardium and blood of chronic heart failure(CHF)rats.MethodsCHF was induced by ligating the left anterior descending coronary artery in 60 male SD rats,then the CHF rats were randomly divided into two groups with 30 animals in each.CHF rats in study group were treated with intravenous injection of Ghrelin;those in control group were treated with intravenous injection of normal saline.The myocardium morphology andultrastructure were observed by light and electron microscopy on d2,d20 and d45 after CHF induced;left ventricular function was evaluated by polygraphy;expression of TRXand ASK1 proteins in myocardial tissue were detected by immunohistochemistry;the expression of TRX and ASK1 mRNA was detected by RT-PCR.ResultsThe myocardial injury of rats on d2,d20 and d45 after modeling in control group was more severe than that in study group.Electron microscopy also showed that the myocardial damage on d45 in control group was more severe than that in study group.(P＜0.05);the left ventricular ejection fraction(LVEF)and left ventricular fraction shortening(LVFS) in study group were higher than those in the control group(P＜0.05).The immunohistochemical ASK1 positive area and the expression ASK1 mRNA in myocardia tissue on d45 in the study group were lower than those in the control group,wile the immunohistochemical TRXpositve area and the expression of TRXmRNA in myocardial tissue were significantly higher than those in the control group(P＜0.05).ConclusionGhrelin can downregulate ASK1 expression and upregulate TRX expression in CHF myocardium,and decrease the content of ASK1 and increase the content of TRX in the blood,so as to improve the biological function of CHF.

Heart failureMyocardiumPathologyCardiac muscle cellsApoptosis

2017-02-27）

（本文编辑：沈昱平）

10.12056/j.issn.1006-2785.2017.39.13.2017-394

黑龙江省教育厅基础研究类（自然类）面上项目（JMSUJCM2016-048）

154002佳木斯大学附属第一医院重症医学科

陈振栋，E-mail：chenzhendong0507@163.com