华南地区人细小病毒B19和Parv4感染与早期自然流产关系

2017-08-04 07:41余燕欧国灯杜耀民梁蔚阳邓锋
中国医药科学 2017年10期

余燕?欧国灯?杜耀民?梁蔚阳?邓锋

[摘要] 目的 通过对近年来华南地区早期自然流产孕妇的血清样品的B19和Parv4感染状况调查,分析华南地区人细小病毒感染与早期自然流产的关系。方法 选取门诊确诊的379例早期自然流产患者,采用q-PCR方法检测B19和Parv4的感染状况及病毒载量,以同期348例人工流产孕妇进行对比,将相关数据进行统计分析。结果 华南地区孕妇人群中B19感染率略高于已有调查地区,妊娠期前后B19和Parv4感染与妊娠不良结局有密切关系。结论Parv4常与B19合并感染,B19指标在很大程度上同时可以反映Parv4的风险。

[关键词] 华南地区;细小病毒;q-PCR;早期流产

[中图分类号] R714.21 [文献标识码] A [文章编号] 2095-0616(2017)10-07-04

Relationship between human parvovirus B19 and Parv4 infection and spontaneous abortion in Southern China

YU Yan1 OU Guodeng1 DU Yaomin2 LIANG Weiyang1 DENG Feng1

1.Guangdong Institute for Drug Control,Guangzhou 510180,China;2.Guangdong General Hospital,Guangzhou 510180,China

[Abstract] Objective To investigate the relationship between infection and early spontaneous abortion in Southern China,to investigate the serum B19 and Parv4 infection in pregnant women with early spontaneous abortion in recent years. Methods 379 cases of patients with early abortion diagnosed in clinic were selected,The q-PCR method was used to detect infection and virus B19 and Parv4 load.At the same period, 348 cases of artificial abortion of pregnant women were selected as control.The relevant data was statistically analyzed. Results The prevalence of B19 infection in pregnant women in Southern China area is slightly higher than that in the investigated areas. Conclusion The B19 and Parv4 infection before and after pregnancy are closely related to the adverse pregnancy outcomes.Parv4 often associates with B19 infection. B19 indicators can largely reflect the risk of Parv4.

[Key words] Southern China;Parvovirus;q-PCR;Early abortion

以B19和Parv4为代表的人细小病毒感染与危害问题已引起国内外医药和医疗行业高度关注。B19导致的疾病与很多因素有关,包括B19病毒的直接侵袭、机体免疫介导反应、个体遗传差异(如机体HLA、P血型等问题)以及机体的免疫状态等[1-4]。此外也有研究表明,B19的感染与肝肾、神经系统的损伤和多种血液疾病有一定关系[5-6]。据笔者前期研究的统计,约4%~ 5%的血液制品中可检测出PARV4或其变种PARV5,在HCV、HBV感染者甚至部分健康獻血者血浆中(<2%)也可检出。Parv4虽未证实存在直接致病性,但其潜在风险和间接危害不容忽视[7-11]。已有研究报道,B19可能与妊娠早期的自然流产有关[12-15]。

此外,目前国内尚无B19和Parv4病毒的标准

检测方法,实验室检测两种病毒最常用的方法主要有核酸检测法和血清学检测法[16-22]。前者主要包括斑点杂交、原位杂交及PCR等方法;后者主要有通过检测IgG和IgM的构象表位抗体的抗体检测法,以及通过原核表达系统及真核表达系统来制备的、以检测病毒衣壳蛋白VP1和VP2的抗原检测法,笔者在前期研究中已建立准确度较高、快速灵敏的q-PCR方法[23]。本文试图通过对多例妊娠早期自然流产与人工流产的孕妇血清中细小病毒感染率的差异,以探究细小病毒B19和Parv4与早期自然流产之间的关系。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2013年6月~2016年10月于广东省人民医院(含东川路门诊和惠福西路门诊)经门诊及住院检查收集的379例不明原因流产或死胎的孕妇血清作为研究组,平均年龄为(28.1±4.2)岁,流

产时妊娠天数为23 ~ 71d,考虑到对照组的可比性,同时在上述门诊以同期同地随机选取人工流产的348例健康孕妇的血清为对照组,平均年龄为(24.2±2.5)岁,流产妊娠天数为40~77d。对照组和研究组在年龄和流产次数等一般资料比较差异无统计学意义(P>0.05),具有可比性,且所有病例均通过诊断排除是由于母体免疫疾病、内分泌失调、遗传基因缺陷、子宫或生殖道畸形、宫腔黏粘以及不良外界环境影响、弓形虫、巨细胞病毒、单纯疱疹病毒感染等多种原因所造成的流产。endprint

1.2 样品DNA的提取

无菌留取上述研究对象静脉血5mL,加入细胞裂解液后,混匀,离心2000g 5min,离心后分离血清,按试剂盒说明操作,提取的病毒DNA-20℃保存备用。

1.3 材料及方法

1.3.1 仪器 Ultrospec2100核酸蛋白快速测定仪(购自美国GE公司);Gene Amp PCR System 9700核酸扩增仪(购自美国AB公司);Bio-rad DNA 凝胶电泳仪(购自美国 Bio-rad公司);Bio-rad凝胶成像系统(购自美国Bio-rad公司);Applied Biosystems 7300 Real-time PCR system(购自美国AB公司);5804R低温冷冻离心机(购自美国Eppendorf公司)。

1.3.2 试剂 质粒提取试剂盒(购自北京天根生物有限公司 批号:VT303-01);血液病毒DNA/RNA 小量提取试剂盒(购自上海妙骏生物有限公司 批号:GD2311-01)。Premix Taq 扩增反应液( 购自 Takara 公司 批号:3027A) ;血样中B19和Parv4的检测荧光定量试剂盒(自主研发)。该自主研发试剂盒所选取的B19、Parv4的引物及探针由上海生物工程有限公司合成。见表1。

1.3.3 荧光定量PCR检测 将提取的血清DNA分别进行B19,parv4荧光定量检测,B19PCR扩增反应体系为:2×Premix Mix 12.5μL、酶0.25μL、B19.F/R

(10μmol/L)各1μL,B19-p(5μmol/L)1μL、DNA 5 μL、雙蒸水4.25μL,总反应体积为25μL;Parv4检测方法相同,仅加入引物及探针做对应调整。反应条件:50℃ 30min,然后以95℃ 2min、95℃ 5s、56℃ 50s 进行40个循环;结果通过CT值(CT<35)判别阳性。

1.4 统计学处理

统计学软件采用SPSS 16.0,计量资料以()表示,采用t检验,计数资料以百分比表示,采用χ2检验,等级资料采用秩和检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组B19的q-PCR检测结果

在研究组的379例早期/中期流产孕妇中,B19的q-PCR检测结果呈阳性者共75例,占该组比例为19.7%;而对照组的348例孕妇血清检测结果呈阳性者共12例,占该组比例为3.44%,两组间差异统计学意义显著,P=0.040。研究组的B19阳性统计概率为对照组的6.35倍(95%CI 1.2~17.83)。研究组75例阳性者中,B19浓度范围为1.9×104~3.7×106copies/mL,对照组阳性者中浓度范围为1.2×103~1.8×105copies/mL,研究组阳性者样品中病毒载量高于研究组约1个数量级。

2.2 两组Parv4的q-PCR检测结果

在研究组的379例早期自然流产孕妇中,Parv4的q-PCR检测结果呈阳性者共13例,占该组比例为3.43%;而对照组的348例孕妇血清检测结果呈阳性者共3例,占该组比例为0.86%,两组间差异统计学意义显著,P=0.042。研究组的Parv4阳性统计概率为对照组的5.34倍(95%CI 1.1~15.83)。

研究组13例阳性者中,Parv4浓度范围为3.1×103~2.7×105copies/mL,对照组阳性者中浓度范围为1.2×103~1.8×104 copies/mL,研究组阳性者样品中病毒载量显著高于研究组。

值得注意的是,在早期自然流产孕妇中Parv4检测呈阳性者的13例中,有12例B19的检测也呈阳性,而在对照组的Parv4检测呈阳性者的3例中,也有2例B19的检测结果呈阳性。

3 讨论

HPV B19是细小病毒科细小病毒属中一大类目前已知的可使人类致病的、结构最简单的无包膜线状单链DNA 病毒,感染B19后临床表现可为无明显症状、传染性红斑及头痛发烧、慢性贫血及短暂性再生障碍危象等[22] ,此外HPV B19也会导致宫内感染引起一些不良妊娠结局如孕妇非免疫性流产及胎儿水肿等;Parv4是另一种稍晚发现的一类细小病毒,其危害尚未明确,多数认为与B19具有一定相似性,两者均可通过呼吸道、血液制品、输血等方式传播,儿童和孕妇为主要易感人群[24]。据报道地方性流行时孕妇发病率可达1%~2%,而幼儿教师、儿童等发病率更是高达20%~30%[25]。笔者在前期的无偿献血样品调查中也发现,华南地区的健康献血者中B19携带率已高达3-7%,Parv4的携带率统计数据较少,但一般认为远低于B19[23]。

在1984年有研究人员首次报道B19可通过胎盘垂直传播[26],欧美研究报道,在B19病毒感染的流行期,其中3%~8%的孕妇存在急性感染,胎盘垂直传播率为33%~51%,有5%~16%的感染孕妇出现了严重胎儿发病和死亡,因为B19病毒对人骨髓和脾脏中的祖代红细胞具有特殊嗜性,妊娠中期胎儿红细胞快速增长且寿命较短,不能形成有效的免疫反应来对抗感染,故胎儿感染B19后会使胎儿造血系统的红系造血细胞受到破坏,胎儿发生造血危象、严重贫血、水肿及神经系统畸形等,故而引起胎儿水肿和死胎[27]。有研究发现,感染B19的孕妇患早期流产的风险性是未感染组的3.76倍[28]。另有研究数据表明,B19病毒是我国孕妇非免疫性流产等疾病的重要病因之一,并可发生于妊娠期任何时期,尤以旱中期妊娠多见[29]。对某地186例B19感染孕妇调查结果表明,胎儿受染率为33%,胎儿死亡率为9%[30]。有研究发现患者血清中B19IgM阳性率为23.08%,明显高于对照组的6.67%,表明妊娠早期自然流产与近期B19存在密切联系[31]。endprint

从本研究的数据来看,华南地区孕妇人群中B19感染率略高于国内其它已有调查地区,可能原因为本研究所采用感染检测方法的灵敏性有关。多数文献均只研究妊娠期前后B19感染与妊娠不良结局的密切关系。而本研究发现不仅B19且Parv4感染均可造成胎儿畸形、胎儿水肿、死胎等,均是妊娠早期自然流产的原因之一。因此预防B19和Parv4感染以及孕前或孕早期B19和Parv4的筛查对预防不良妊娠结局的发生和优生优育有重要意义。同时研究也发现,Parv4常与B19合并感染,B19指标在很大程度上同时可以反映Parv4的風险。因此血清中的B19可能预示着存在包括Parv4在内的其它人细小病毒的感染风险。

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(收稿日期:2017-04-06)endprint